1、背景：
　　 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見、高發(fā)的惡性腫瘤之一，肝細(xì)胞癌術(shù)后的高復(fù)發(fā)率成為影響其生存率和預(yù)后的最主要因素之一。但其根本的病因及機(jī)制尚不明了。深入研究原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，及早預(yù)測(cè)原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性，從而有效改善原發(fā)性肝癌病人的預(yù)后，在當(dāng)前有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。核仁紡錘體相關(guān)蛋白1(nucleolarspindle-associated prote

2、in1，NuSAP1)是一種微管合蛋白，在紡錘體組裝中發(fā)揮重要功能，是保證細(xì)胞周期正常進(jìn)行的重要調(diào)控分子。NuSAP1的mRNA水平和蛋白水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，在細(xì)胞周期進(jìn)程中呈現(xiàn)周期性變化。轉(zhuǎn)錄因子E2F家族在控制細(xì)胞周期的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，NuSAP1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有E2F的結(jié)合位點(diǎn)，E2F1和E2F結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后可明顯促進(jìn)NuSAP1的轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在許多其它腫瘤中存在NuSAP1的過(guò)表達(dá)，它們的表達(dá)水平往往和腫瘤的侵襲性

3、及預(yù)后有關(guān)。有關(guān)NuSAP1在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及與腫瘤侵襲性、預(yù)后的關(guān)系還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。
　　 目的：
　　 鑒于NuSAP1家族在細(xì)胞周期中的重要作用，其功能的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)可能存在著密切關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞水平和組織水平研究NuSAP1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，分析NuSAP1在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床意義及其與E2F1的關(guān)系，探討NuSAP1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及其分子機(jī)

4、制。
　　 方法：
　　 1.收集手術(shù)切除的新鮮肝細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的非癌組織標(biāo)本，采用RT-PCR、熒光定量PCR檢測(cè)癌和非癌組織標(biāo)本中NuSAP1的mRNA表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)癌和非癌組織標(biāo)本中NuSAP1、E2F1蛋白表達(dá)水平，分別分析NuSAP1、E2F1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與相關(guān)臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;并探討E2F1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與NuSAP1表達(dá)的關(guān)系。
　　 2.采用人高轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌

5、細(xì)胞株HCCLM3，利用SiRNA定向抑制NuSAP1的表達(dá)，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)抑制前后HCCLM3細(xì)胞株中NuSAP1mRNA表達(dá)的變化;采用Western blotting方法檢測(cè)抑制前后HCCLM3細(xì)胞株中NuSAP1蛋白表達(dá)的變化;使用Freshney計(jì)數(shù)板計(jì)量細(xì)胞數(shù)目的變化;MTS和Edu法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化;transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞侵襲能力的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化;分析其表達(dá)

6、對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響;
　　 3.采用人高轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌細(xì)胞株MHCC97H，利用SiRNA定向抑制E2F1的表達(dá);采用熒光定量PCR方法檢測(cè)抑制前后MHCC97H細(xì)胞株中NuSAP1mRNA表達(dá)的變化;采用Western blotting方法檢測(cè)抑制前后MHCC97H細(xì)胞株中NuSAP1蛋白表達(dá)的變化;研究在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中E2F1的表達(dá)對(duì)NuSAP1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.無(wú)論是核酸

7、水平還是蛋白水平，NuSAP1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)均明顯高于相應(yīng)的非癌組織(P＜0.05)。單因素分析表明:NuSAP1 mRNA和蛋白的表達(dá)均與TNM分期、巴塞羅那分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、早期復(fù)發(fā)、有無(wú)癌栓和病理分化相關(guān)(P＜0.05); NuSAP1 mRNA的表達(dá)與血清AFP相關(guān)，而NuSAP1蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、肝硬化相關(guān)(P＜0.05);多因素逐步logistic回歸分析表明:NuSAP1蛋白的表達(dá)是早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素(P＜

8、0.05)。生存分析表明NuSAP1在肝細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差相關(guān)(X2=5.939，P=0.015)。肝細(xì)胞癌患者術(shù)后的無(wú)瘤生存期與NuSAP1蛋白表達(dá)的高低相關(guān)(Kaplan-Meier, log-rank test, P＜0.05)。
　　 2.E2F1蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯升高(P＜0.05);肝細(xì)胞癌組織中的E2F1蛋白表達(dá)升高與病理分化、早期復(fù)發(fā)、TNM分期及巴塞羅那分期相關(guān)(P＜0.05)

9、;生存分析表明E2F1在肝細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)也與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差相關(guān)(X2=8.952，P=0.003)。肝細(xì)胞癌患者術(shù)后的無(wú)瘤生存期也與E2F1蛋白表達(dá)的高低相關(guān)（Kaplan-Meier，log-rank test，P＜0.05）。并且E2F1與NUSAP1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)的關(guān)系（P＜0.05）;
　　 3.在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的抑制實(shí)驗(yàn)中，抑制HCCLM3細(xì)胞株NuSAP1的表達(dá)可明顯降低肝細(xì)胞癌的細(xì)胞數(shù)目的增加、抑制細(xì)

10、胞增殖活性、細(xì)胞移動(dòng)性及細(xì)胞侵襲性、促進(jìn)G2/M期轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等（P＜0.05）;抑制MHCC97H細(xì)胞株E2F1的表達(dá)可明顯降低NuSAP1的表達(dá)量(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、NuSAP1在肝細(xì)胞癌組織中存在過(guò)表達(dá)，NuSAP1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的早期復(fù)發(fā)有關(guān)，NuSAP1高表達(dá)者預(yù)后差。
　　 2、E2F1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯升高，并且與NuSAP1的表達(dá)存在正相關(guān)，