1、研究背景：
　　 氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生與清除失衡，進(jìn)而導(dǎo)致組織和細(xì)胞受到氧化損傷。神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，現(xiàn)普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用。因此，清除活性氧自由基和修復(fù)氧化損傷被認(rèn)為是預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病行之有效的策略。番茄紅素(Lycopene)作為類(lèi)胡蘿卜素(Carotenoid)家族中的一員，是自然界存在的

2、高效抗氧化劑，其淬滅單線態(tài)氧的速率常數(shù)是α-生育酚的10倍，β-胡蘿卜素的47倍，維生素E的100倍。番茄紅素可以被人體吸收，通過(guò)“血腦屏障”進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nerve system，CNS)發(fā)揮抗氧化等生物學(xué)功能；流行病學(xué)研究也顯示，長(zhǎng)期攝入富含番茄紅素的食品能夠有效提高老年人的認(rèn)知能力和記憶功能；因此，番茄紅素在氧化應(yīng)激相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治方面的運(yùn)用備受關(guān)注。
　　 三甲基氯化錫(Trimethylt

3、in chloride，TMT)作為一種職業(yè)與環(huán)境危害因素，廣泛應(yīng)用于PVC塑料的穩(wěn)定劑和防銹油漆的添加物。TMT慢性中毒多表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，如頭暈、記憶力減退、認(rèn)知能力下降和精神異常等癥狀；病理表現(xiàn)為大腦邊緣系統(tǒng)，特別是海馬的神經(jīng)元退行性改變。目前公認(rèn)的TMT毒性分子機(jī)制是TMT可以誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量活性氧自由基累積，致使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙甚至凋亡。由于TMT中毒的臨床和病理表現(xiàn)以及毒性機(jī)制與多種神經(jīng)

4、退行性疾病極為相似，近年來(lái)TMT被用于構(gòu)建模擬神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物及細(xì)胞模型。因此，本課題第一部分以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，運(yùn)用TMT建立神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元氧化損傷模型，研究番茄紅素對(duì)TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，以期揭示番茄紅素在氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病防治的潛在價(jià)值。
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一類(lèi)常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。β淀粉樣肽(Beta

5、-amyloid peptide，Aβ)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡被認(rèn)為在AD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，為進(jìn)一步探討番茄紅素在神經(jīng)退行性疾病防治方面的運(yùn)用價(jià)值，本課題第二部分以原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元為研究對(duì)象，運(yùn)用Aβ建立神經(jīng)元氧化損傷模型，研究番茄紅素對(duì)Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的影響及其相關(guān)機(jī)制，豐富番茄紅素在神經(jīng)退行性疾病防治方面的運(yùn)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分番茄紅素拮抗TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷及相關(guān)機(jī)制

6、r>　　 研究方法：
　　 1.采用新生Sprague-Dawley大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，采用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)，采用β-TublinⅢ神經(jīng)元特異性標(biāo)記物運(yùn)用免疫細(xì)胞熒光法鑒定海馬神經(jīng)元。運(yùn)用多個(gè)濃度的TMT處理不同時(shí)間誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷，根據(jù)細(xì)胞活力變化，選擇損傷程度合適的TMT處理濃度和時(shí)間建立細(xì)胞損傷模型。
　　 2.將神經(jīng)元分為對(duì)照組、番茄紅素處理、TMT處理以及番茄紅素+TMT處理組，采用倒置相差

7、顯微鏡觀察處理前后神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化；采用CCK-8和TUNEL原位熒光染色法分別觀察TMT處理神經(jīng)元后細(xì)胞活力和凋亡率的變化，以及番茄紅素干預(yù)后的影響。
　　 3.采用DCFH-DA和Mito-SOX熒光探針?lè)謩e檢測(cè)番茄紅素對(duì)TMT處理后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平的影響。
　　 4.采用基于鈣黃綠素的熒光猝滅法和JC-1熒光探針?lè)謩e檢測(cè)番茄紅素對(duì)TMT處理后神經(jīng)元線粒體膜通道孔(mPTP)和跨膜電位(△ψm)水平

8、的影響。
　　 5.采用細(xì)胞免疫熒光染色法和分光光度法分別檢測(cè)番茄紅素對(duì)TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞色素c釋放和Caspase-3活性的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.原代培養(yǎng)第8天的SD大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)正常。免疫細(xì)胞熒光結(jié)果顯示非神經(jīng)元細(xì)胞污染程度低，神經(jīng)元純度高。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，TMT損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)的關(guān)系，因此選定5μM TMT處理24 h建立TMT誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷模

9、型，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。
　　 2.形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，5μM濃度的TMT處理致使神經(jīng)元突觸斷裂，胞膜不完整，胞體膨脹，胞核固縮，而1μM的番茄紅素預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)這種損傷作用。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素顯著抑制TMT導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞活力下降，而且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)關(guān)系(0.1μM，1.0μM和10μM)和時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)關(guān)系(0 h，12 h，24 h和48 h)；TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以有效抑制TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋

10、亡。
　　 3.DCFH-DA和Mito-SOX熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素不僅抑制TMT誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS累積，而且可以顯著降低線粒體內(nèi)ROS水平。
　　 4.熒光猝滅法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以有效抑制TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜通道孔的開(kāi)放；JC-1熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以顯著抑制TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位去極化。
　　 5.細(xì)胞免疫熒光染色法和分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素顯著抑制TMT誘

11、導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞色素c(Cytochrome c)的釋放和Caspase-3的激活。
　　 結(jié)論：
　　 番茄紅素可以有效拮抗TMT誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，其機(jī)制與抑制神經(jīng)元氧化應(yīng)激、抑制線粒體膜通透性改變和阻斷線粒體凋亡途徑密切相關(guān)。
　　 第二部分番茄紅素拮抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷及相關(guān)機(jī)制
　　 研究方法：
　　 1.采用CCK-8和TUNEL原位熒光染色法觀察Aβ處理神經(jīng)元后細(xì)胞活力和凋亡率的變化，

12、以及番茄紅素干預(yù)后的影響。
　　 2.采用DCFH-DA和Rhodamine123熒光探針檢測(cè)番茄紅素對(duì)Aβ處理后神經(jīng)元活性氧和線粒體膜電位水平的影響。
　　 3.采用Western blot檢測(cè)番茄紅素對(duì)Aβ處理后神經(jīng)元Bax，Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以有效保護(hù)Aβ對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的損傷，而且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)關(guān)系

13、(0.1μM，1.0μM、2.0μM和5μM)；TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以有效抑制Aβ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡。
　　 2.DCFH-DA熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元胞內(nèi)ROS的生成；Rhodamine123熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位降低。
　　 3.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，番茄紅素可以有效逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)Bax/Bcl-2表達(dá)比例升