1、本研究擬通過建立體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肌樣細胞模型，然后鑒定分化前后MSCs分泌抗免疫蛋白分子的特性，并在體外同種異體混合白細胞實驗中探討分化前后干細胞對免疫細胞的耐受能力。課題分為三個部分:
　　第一部分大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導分化為肌樣細胞的研究
　　目的：探討體外使用5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-aza)誘導大鼠骨髓間充質干細胞向肌樣細胞分化的方法，為研究和臨床使用干細胞治療心臟疾病奠定

2、基礎。方法：體外分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs，傳代擴增，使用含10μM5-azaIMDM培養(yǎng)液常規(guī)條件下孵育P4～P5MSCs24h，以后每3天換一次正常IMDM細胞液直到第14天。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，通過免疫組化鑒定肌樣細胞特有標記物MHC，RT-PCR鑒定α-MHC和β-MHC基因表達，Westemblot鑒定MHC蛋白的表達。結果：誘導分化后的d-MSCs形態(tài)上發(fā)生改變，細胞體積大小不等，胞核較前增大，個別可見多核

3、，部分細胞聚集成團簇樣，有管狀結構形成;免疫組化結果顯示，MSCs不表達肌樣細胞特有標記物MHC，d-MSCs開始表達MHC;RT-PCR顯示d-MSCs表達α-MHC和β-MHC基因的水平較MSCs明顯增加;通過Westemblot鑒定d-MSCs表達MHC蛋白的量也比MSCs明顯增加，與基因水平的結果一致。結論：使用5-氮胞苷可成功誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肌樣細胞。
　　第二部分探討MSCs肌樣細胞分化前后分泌抗免疫細胞

4、因子的特性
　　目的：探討大鼠骨髓MSCs向肌樣細胞分化后，其分泌抗免疫細胞因子特性是否有改變，進一步闡明MSCs分化以后失去其免疫優(yōu)勢的具體機制。方法：體外建立5-aza誘導MSCs分化為肌樣細胞的模型，通過RT-PCR篩選基因水平TGF-β、IL10、IDO和影響PGE2分泌的5個基因COX1、COX2、Ptges1、Ptges2、cPtges在分化前后是否有改變;選擇有改變的靶基因，通過Westernblot進一步檢測其蛋白

5、水平是否有改變;最后通過ELISA檢測分化前后干細胞分泌目標細胞因子的能力是否有改變。結果：RT-PCR篩選結果顯示TGF-β、IL10、IDO基因在MSCs分化前后表達無明顯差異，影響PGE2表達的COX1、Ptges2、cPtges基因表達也無明顯改變，只有COX2、Ptges1基因在分化后表達水平明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05);Westemblot檢測結果顯示分化后d-MSCs表達COX2、Ptges1蛋白的水平也明顯降低

6、(P＜0.05);ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中分泌的PGE2水平顯示，分化后d-MSCs分泌PGE2的能力明顯降低(P＜0.05)。結論：MSCs心肌細胞分化以后分泌抗免疫PGE2水平下降,這種分子機制改變可能參與了d-MSCs引起的同種異體免疫反應。
　　第三部分PGE2在同種異體混合白細胞試驗中對肌樣分化后MSCs的保護作用
　　目的：進一步證實MSCs分化后誘導了同種異體白細胞的殺傷作用，探討PGE2能否起到保護干細胞不

7、受免疫細胞損傷的作用。方法：用不同濃度PGE2處理MSCs或d-MSCs72h后，通過LDH檢測試劑盒測定培養(yǎng)液中釋放的LDH量，鑒定單純PGE2對干細胞的毒性作用;分離Lewis大鼠外周血白細胞(peripheralbloodleukocytes，PBLs)，與分化前后Wistar大鼠干細胞進行混合白細胞試驗，常規(guī)孵育72h后檢測培養(yǎng)基中LDH釋放量;為了評價PGE2的作用，我們直接加10ng/ml或50ng/mlPGE2在d-MSC

8、s混合白細胞試驗體系中，檢測培養(yǎng)基中LDH釋放量。同時,我們也使用PGE2預處理d-MSCs4天，或預處理PBLs5h，然后再進行混合白細胞試驗，檢測培養(yǎng)基中LDH釋放量。結果：10ng/ml或50ng/mlPGE2處理干細胞后，與對照組相比LDH釋放量無明顯改變(P＞0.05)，說明單純PGE2對MSCs或d-MSCs無明顯細胞毒性;分化前后干細胞與同種異體混合白細胞反應，MSCs實驗組與對照組LDH釋放量無明顯差別，d-MSCs實驗

9、組較對照組釋放較多LDH(P＜0.05)，證實MSCs分化后誘導了同種異體白細胞的殺傷作用;直接PGE2處理組(10PGE2+PBLs或50PGE2+PBLs)與對照組相比，釋放LDH量增加，直接加入PGE2不能起到保護d-MSCs的作用;PGE2預處理d-MSCs組（10p-PGE2+PBLs或50p-PGE2+PBLs）與+PBLs實驗組相比釋放LDH量明顯降低(P＜0.05)，兩個預處理組與對照組相比釋放LDH量無統(tǒng)計學差異(P＞

10、0.05)，PGE2預處理d-MSCs可起到保護細胞的作用;PGE2預處理PBLs組（10PGE2+p-PBLs或50PGE2+p-PBLs）與+PBLs實驗組相比釋放LDH量明顯降低(P＜0.05)，兩個預處理組與對照組相比釋放LDH量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，PGE2預處理PBLs也可起到減少同種異體白細胞毒作用。結論：肌樣分化后干細胞分泌PGE2水平的降低參與了d-MSCs引起的同種異體免疫反應，使用PGE2預處理d-MSC或