1、背景和目的：干細胞(stemcell)研究是20世紀與21世紀之交生命科學中的強大潮流，其基礎研究及開發(fā)應用將打開對疾病治療的突破口，成為21世紀生物產(chǎn)業(yè)的核心內(nèi)容之一。神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)是干細胞的一種，Reynolds等于1992年首先從成年小鼠腦紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖、具有多種分化潛能的細胞群，并正式提出了神經(jīng)干細胞的概念。NSCs不僅可以作為研究神經(jīng)發(fā)育的模型，并且可作為潛在的移植細胞

2、的來源，為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一個新的有效治療途徑。目前國內(nèi)外已經(jīng)積累了治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型，并為治療神經(jīng)系統(tǒng)各種先天性、退行性疾病及后天性損傷疾病提供了大量的理論依據(jù)。然而如何獲得足夠數(shù)量的可移植細胞且避免倫理道德及臨床方面的爭議成為目前NSCs替代治療的一大障礙。近年來，國內(nèi)外一些學者證明骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)在體內(nèi)外適宜條件下可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)樣細胞，并且能促進

3、神經(jīng)功能的恢復，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一個新的手段。終絲是脊髓圓錐末端聯(lián)系尾骨的連接物，它曾被簡單地認為是血管附著物，但后來組織學研究發(fā)現(xiàn)在終絲內(nèi)存在著神經(jīng)組織。國外曾對成人終絲進行了免疫過氧化酶染色，也得出終絲中含有大量膠質(zhì)細胞、分散的神經(jīng)元細胞及其他組織。近來，國內(nèi)外實驗表明神經(jīng)組織液在體外合適條件下可以誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞轉(zhuǎn)化，但多為損傷或正常腦或脊髓組織，用終絲進行誘導還未見報道。那么能否用終絲勻漿液來誘導BMSCs

4、分化為神經(jīng)樣細胞呢?本實驗就這一目的探討人終絲勻漿上清液體外誘導BMSCs分化為神經(jīng)樣細胞的可行性，為將來進一步探討研究終絲及BMSCs的生物學特性或獲取治療用種子細胞提供論理依據(jù)。 材料與方法：由一名7歲骨髓相正常的TCS患兒術(shù)前自愿捐獻骨髓。將骨髓標本緩慢疊加到淋巴細胞分離液上進行離心，取中間白色云霧狀細胞層(含有BMSCs)。將分離得到的BMSCs在DMEM/F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清中進行無分化培養(yǎng)，當細胞接近融合時進

5、行傳代。術(shù)中留取該患兒之終絲稱濕重后進行勻漿，離心后取上清，纖維素濾膜過濾除菌，所得液體-20℃冰箱中保存。將第四代細胞在實驗組和對照組中的培養(yǎng)皿中進行爬片，各組均加入含有bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)10ng/ml的培養(yǎng)液，促進細胞分裂。24h后撤去bFGF，實驗組加入無血清培養(yǎng)基及勻漿上清液誘導，對照組只加培養(yǎng)基，72小時后免疫細胞化學鑒定。統(tǒng)計分析神經(jīng)細胞特異性標志物NF(神經(jīng)微絲蛋白)、NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)、GFA

6、P(神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白)陽性細胞數(shù)，得出結(jié)論。 結(jié)果：誘導2h后觀測細胞形態(tài)已經(jīng)開始發(fā)生變化：BMSCs胞體向胞核收縮且變得致密及有折光性，漸漸變?yōu)轭愃棋F形、多角形及類圓形，從胞體開始伸出突起，突起延長成細絲狀，到第2d時相鄰細胞的突起已經(jīng)相互交織成網(wǎng)狀，表現(xiàn)為大小不一、形狀不同但有自細胞發(fā)出突起的典型神經(jīng)樣細胞。大約有17％的細胞發(fā)生上述形態(tài)學變化。染色后每個指標隨機選擇10個視野進行陽性細胞計數(shù)，算出平均值。NF陽性率為15.