1、實驗背景心肌細胞不可逆性死亡及纖維瘢痕增生，是心血管病患者心功能進行性惡化甚至死亡的重要原因之一。藥物治療、介入治療和心外冠脈搭橋術(shù)不能逆轉(zhuǎn)壞死的心肌，因此不能治愈嚴(yán)重心肌損傷的心衰患者，臨床療效局限。心臟移植由于受供體和費用的限制，也難以廣泛開展。近年來對干細胞理論及技術(shù)研究的逐漸深入，發(fā)展速度超然，已經(jīng)取得了初步的實驗成果。這些重要發(fā)現(xiàn)為修復(fù)和重建病損心肌提供了很好的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外研究證實多種胚胎及成體干細胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境中加入

2、某種有效成份時可在體外誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞。自體骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有操作簡單，取材方便，無免疫排異性，還具有很好的增殖和多向分化潛能及倫理學(xué)優(yōu)勢，因此MSCs逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重點。大量研究證實MSCs在體外可經(jīng)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞，但因為對MSCs心肌樣細胞化的分子調(diào)機制不完全明確，所以目前尚未發(fā)現(xiàn)某一種化學(xué)物質(zhì)能特異性地誘導(dǎo)MSCs全部向心肌樣細胞分化，這些都為MSCs的臨床應(yīng)用造成困難，很有必要進行進一

3、步的深入探討。如果能夠把MSCs高質(zhì)量的誘導(dǎo)分化為心肌細胞，并以此修復(fù)壞死心肌組織，將具有廣闊的醫(yī)療前景。 目的1.體外分離、純化、傳代hBMMSCs。 2.對比研究5-aza、AngⅡ、8-Br-cAMP、SP對hBMMSCs的誘導(dǎo)分化作用，篩選更加合理的分化誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)克隆方法。 3.初步探討AngⅡ誘導(dǎo)hBMMSCs向心肌樣細胞分化時可能涉及的信號通路。 方法第一部分：自正常人髂骨抽取骨髓，以1.0

4、77g/mlFicoll分離液分離純化hBMMSCs，用低糖DMEM在體外培養(yǎng)、傳代。 第二部分：收集第8代hBMMSCs，分為實驗組和空白對照組。實驗組分4個亞組，分別用10μmol/L5-aza、0.1μmol/LAngⅡ、1mol/L8-Br-cAMP、0.1μmol/LSP誘導(dǎo)孵育hBMMSCs24h。各組細胞通過倒置顯微鏡、免疫細胞化學(xué)法、RT-PCR法、透射電鏡觀察鑒定誘導(dǎo)細胞是否具備心肌樣細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點及是否

5、表達心肌特異性蛋白a-actin和cTnI，最后用流式細胞儀測定各組心肌樣細胞誘導(dǎo)分化率。用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析比較組間分化率均數(shù)差異。 第三部分：應(yīng)用Westernblot法檢測AngⅡ組及空白對照組細胞第1d、3d、7d、11d同時相ERK1/ERK2總蛋白表達量，觀察ERK通路活化情況。 實驗結(jié)果1.原代hBMMSCs培養(yǎng)24h后可見呈單個核細胞樣，體小而圓，漿少核大，核清晰可見。3-4d后細胞呈集落樣生長

6、，細胞呈短梭形、多角形或紡錘形。2w后細胞克隆擴大，彼此相連，胞體為長梭形，排列緊密，此hBMMSCs形態(tài)保持至第8代。 2.5-aza、8-Br-cAMP、SP誘導(dǎo)hBMMSCs2w時，細胞明顯變寬，呈短棒狀，誘導(dǎo)4w時細胞呈長桿狀，走向趨于一致，鄰近細胞間連接較前緊密，相互融合形成肌管樣結(jié)構(gòu)；而AngⅡ誘導(dǎo)的細胞第8-10d即呈棒狀，第18-21d細胞為長桿狀，走向便趨一致。5-aza、8-Br-cAMP、SP3組細胞第3w

7、開始逐漸表達a-actin，第4w逐漸表達cTnI，而AngⅡ誘導(dǎo)的細胞第2w即開始表達a-actin，第3w已表達cTnI。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測證實：5-aza、8-Br-cAMP、SP3組細胞第4w表達心肌特異性肌鈣蛋白Ⅰ，而AngⅡ組為第3w。第4w時透射電鏡可見各實驗組細胞內(nèi)的微肌絲和線粒體，細胞器聚集在核周圍，符合心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。空白對照組hBMMSCs無形態(tài)變化，不表達心肌特異蛋白，也未觀察到類心肌細胞超微

8、結(jié)構(gòu)。流式細胞儀檢測各組中FITC陽性標(biāo)記cTnI的心肌樣細胞分化率分別為5-aza組：24.11±10.97％；AngⅡ組：22.67±9.33％；SP組：14.24±8.67％；8-Br-cAMP組：12.84±6.85％；空白對照組：0.77±0.21％(以該流式細胞儀檢測標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為結(jié)果＜1者，即為陰性)。方差分析結(jié)果顯示，各實驗亞組的分化率顯著高于空白對照組，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，而5-aza與AngⅡ組、SP與8-Br-cAMP組間分

9、化率均數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05％)，但5-aza和AngⅡ組分化率高于SP和8-Br-cAMP組，組間均數(shù)有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05％)。 3.AngⅡ組細胞誘導(dǎo)第1d時ERK1/ERK2蛋白表達水平與空白對照組相比無明顯差異，而第3d、7d、11d時，AngⅡ組細胞ERK1/ERK2的蛋白表達水平逐漸增加，顯著高于空白對照組。 結(jié)論1.體外分離、培養(yǎng)hBMMSCs具有很好的成功率及成活率。 2.5-az