1、一、研究背景：
　　 食管癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在男性中位居第四位，其中鱗狀細(xì)胞癌是主要的病理類型。隨著醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，也經(jīng)過我國廣大醫(yī)務(wù)工作者的不懈努力，食管癌的發(fā)病率和死亡率有了明顯改善。然而，雖經(jīng)積極手術(shù)治療，同時結(jié)合術(shù)前新輔助、術(shù)后輔助化療，術(shù)前新輔助、術(shù)后輔助放療及免疫生物治療、中醫(yī)中藥等多種綜合治療方案，食管癌的五年生存率仍然維持在30％左右，30多年來沒有明顯增加，究其原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。相當(dāng)一部分患者

2、，就診時腫瘤分期較低，治療前也無明顯轉(zhuǎn)移證據(jù)，在行腫瘤根治術(shù)后卻早期死于腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。這說明，存在用常規(guī)臨床檢驗(yàn)和組織病理學(xué)方法不能檢出的癌細(xì)胞播散或隱性轉(zhuǎn)移。目前常用的腫瘤檢測方法包括影像檢查及血液中相關(guān)腫瘤標(biāo)記物檢測。影像學(xué)檢查只能發(fā)現(xiàn)生長到一定大小的腫瘤，如大于1cm的腫瘤，但等到影像學(xué)發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)失去了最佳治療的機(jī)會。血液中相關(guān)腫瘤標(biāo)記物是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的一種方法，比如不同的mRNA標(biāo)記物、循環(huán)DNA標(biāo)記物、循環(huán)腫瘤細(xì)胞端粒酶

3、等，但這些標(biāo)志物的特異性較差，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，難以提供精確的臨床信息。而活體組織病理檢查雖然是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但取得活體組織的方法創(chuàng)傷較大，也不能隨時進(jìn)行，無法很好的評價腫瘤的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來，隨著對循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了將循環(huán)腫瘤細(xì)胞作為一種微創(chuàng)、準(zhǔn)確的方法來評價腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著免疫磁珠、納米免疫磁珠、多色熒光標(biāo)記和生物細(xì)胞分選芯片等細(xì)胞分選技術(shù)、RT-PCR等分子技術(shù)的快速發(fā)展，從外周血

4、分離、富集血液中的稀有細(xì)胞即循環(huán)腫瘤細(xì)胞成為可能。但循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離、富集和鑒定的方法國際上尚無公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，不同檢測方法的結(jié)果差異也較大，一定程度上阻礙了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的深入研究。雖然如此，很多基于不同方法的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究報道都證實(shí)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，隨時檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于評價患者的腫瘤進(jìn)展情況，可以在出現(xiàn)癥狀、腫瘤播散前及時采取必要的治療方案，最大限度地抑制腫瘤進(jìn)展，同時，動態(tài)監(jiān)測腫瘤不同治療階段循環(huán)腫

5、瘤細(xì)胞的變化有助于評價治療方案的有效性，據(jù)此隨時調(diào)整治療方案，選擇最佳的個體化治療方案，以提高腫瘤患者的治療效果，延長生存時間，改善生活質(zhì)量。因此，在目前的個體化治療模式下，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以對個體化治療方案的確定提供強(qiáng)有力的依據(jù)。現(xiàn)在，對實(shí)體瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究越來越受到人們的關(guān)注，對各種實(shí)體瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究日益深入，對乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究較多，也取得了很多有意義的結(jié)果。而目前有關(guān)食管鱗癌循

6、環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測方法及臨床意義的研究很少。
　　 二、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用基于負(fù)性篩選策略的免疫熒光染色技術(shù)檢測食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，評價該方法檢測食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的效用，嘗試建立一種簡便、快速、高效的食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法，同時探討食管鱗癌外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出水平的臨床意義，分析術(shù)前血食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與臨床病理特征的相關(guān)關(guān)系，分析術(shù)前、術(shù)后血循環(huán)腫瘤細(xì)胞不同檢出水平組的無展生存時間

7、的差異，評估食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展程度的關(guān)系，為外周血CTCs作為食管鱗癌患者的預(yù)后評價提供證據(jù)。
　　 三、材料和方法：
　　 1、材料
　　 采集海軍總醫(yī)院胸外科2009年4月-2010年8月收治的48例食管鱗癌患者的術(shù)前一天、術(shù)后七天的清晨空腹外周靜脈血，共96例標(biāo)本?；颊呒{入和排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前明確診斷的食管鱗癌初治患者，術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，知情同意。
　　 回顧分析患者

8、臨床病理特征和隨訪資料，研究時限為術(shù)后34個月。無進(jìn)展生存時間(Progression-freeSurvival，PFS)為手術(shù)后到腫瘤復(fù)發(fā)時間。詳細(xì)記錄患者的臨床信息，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤大小及侵犯程度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、p-TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)時間、術(shù)前、術(shù)后CTCs數(shù)量。
　　 2、方法
　　 于術(shù)前一天、術(shù)后七天采集食管鱗癌患者清晨空腹外周靜脈血7.5ml，24小時內(nèi)富集腫瘤細(xì)

9、胞。用紅細(xì)胞裂解液去除食管鱗癌外周血樣本中的紅細(xì)胞，用Miltenyi免疫磁珠去除白細(xì)胞，富集上皮來源的稀有細(xì)胞，用免疫熒光染色技術(shù)鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞。經(jīng)過Mitineyi磁珠富集后，食管鱗癌患者外周血檢出CK8/18/19角蛋白抗原陽性/CD45白細(xì)胞表面抗原陰性的上皮來源細(xì)胞，同時，可見CK8/18/19陰性/CD45陽性的白細(xì)胞。
　　 3、循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與臨床病理意義的分析
　　 目前乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究較為

10、成熟，F(xiàn)DA于2004年批準(zhǔn)CellSearch系統(tǒng)用于檢測乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞輔助療效評價和預(yù)后判斷，該系統(tǒng)研究證實(shí)，采用循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量界定5來判斷療效及預(yù)后分析有臨床意義。在其他實(shí)體腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究中，也多選擇3個或5個為陽性結(jié)果界定標(biāo)準(zhǔn)，如前列腺癌、結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量陽性界定值為3。各種實(shí)體腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究也證實(shí)，相當(dāng)比例患者外周血中并未檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的分布呈偏態(tài)分布，不能直接用循環(huán)腫

11、瘤細(xì)胞的數(shù)量作為腫瘤分期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的判斷標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外至今尚無食管癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)參考其他實(shí)體腫瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究，數(shù)量小于3個為檢出陰性，大于等于3個為檢出陽性。對食管鱗癌患者術(shù)前血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，包括性別、年齡、腫瘤位置、細(xì)胞分化程度、原發(fā)腫瘤侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及p-TNM分期。分別分析術(shù)前、術(shù)后血循環(huán)腫瘤細(xì)胞不同檢出水平組的無展生存時間的差異。
　　 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計<

12、br>　　 等級變量的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析;用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析原發(fā)腫瘤侵犯程度、細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤TNM分期與CTCs檢出水平之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法分析病人的無進(jìn)展生存時間，比較不同CTCs水平患者的中位無進(jìn)展生存時間。用log-rank檢驗(yàn)行組間無進(jìn)展生存時間的比較。所有的統(tǒng)計分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05為具有顯著性差異。
　　 四

13、、結(jié)果：
　　 1、經(jīng)過Mitineyi磁珠富集后，食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出率為64.6％(31/48)，中位數(shù)2(0-72)。術(shù)后外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出率相同，為64.6％(31/48)，中位數(shù)2(0-36)。術(shù)前血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出陽性與細(xì)胞分化程度(R=0.431，P=0.002)、原發(fā)腫瘤侵犯程度(R=0.403，P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(R=0.339，P=0.019)及p-TNM分期(R=0.394，

14、P=0.006)有顯著相關(guān)關(guān)系。分化程度越低(x2=9.636，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多(x2=4.218，P=0.040)、p-TNM分期越晚(x2=8.392，P=0.004)，CTCs檢出陽性率越高。
　　 2、術(shù)前組CTCs＜3和CTCs≥3兩組的中位無進(jìn)展生存時間分別為20個月(95％可信區(qū)間17.134-22.866)和13個月(95％可信區(qū)間11.161-14.839)，術(shù)后血CTCs＜3和CTCs≥3兩組

15、的中位無進(jìn)展生存時間為分別為20個月(95％可信區(qū)間16.763-23.237)和13個月(95％可信區(qū)間11.518-14.482)。術(shù)前、術(shù)后血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出陽性組的術(shù)后無進(jìn)展生存時間較檢出陰性組低，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。(術(shù)前組x2=9.403，P=0.002，術(shù)后組x2=23.049，P=0.000)
　　 五、結(jié)論：
　　 1、基于負(fù)性篩選策略的免疫熒光技術(shù)，可以有效分離、富集、鑒定食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞

16、，檢出率與其他實(shí)體腫瘤檢出率相近。
　　 2、食管鱗癌患者術(shù)前血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出水平與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、p-TNM分期有顯著相關(guān)關(guān)系，與患者性別、年齡、腫瘤的位置無顯著相關(guān)關(guān)系。
　　 3、食管鱗癌患者血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出陽性組較循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出陰性組無進(jìn)展生存時間顯著降低。
　　 4、食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出水平可以反應(yīng)腫瘤的進(jìn)展程度，可以作為食管鱗癌患者的預(yù)后評價指標(biāo)之