1、腦缺血是臨床上常見的急性腦血管疾病，具有高致殘率、高致死率。如何積極有效地促進腦缺血患者神經(jīng)功能的恢復仍然是目前腦缺血研究的重點。近十幾年來，人們發(fā)現(xiàn)在成年腦組織內(nèi)存在具有多種潛能的神經(jīng)干細胞(NSC)，能增殖分化，可在一定條件下分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，改變了以往認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不能再生的認識。大量研究表明，神經(jīng)干細胞(NSC)在神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)環(huán)境的調(diào)控下可對因缺血損傷而造成的神經(jīng)功能喪失產(chǎn)生代償和修復作用。當

2、前，有關(guān)中醫(yī)藥對腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖分化的影響已成為研究的熱點，中醫(yī)藥促進腦缺血后神經(jīng)功能的恢復作用是否與其誘導腦缺血后NSC的增殖分化有關(guān)?這為我們闡明中藥促進腦缺血損傷后腦功能重建和再生機制，開發(fā)具有誘導腦缺血后內(nèi)源性NSC的增殖分化的中藥提出了新的研究思路。通心絡對腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖分化作用的研究尚未見到，本實驗就此作一初步研究。 大量研究表明，神經(jīng)干細胞(NSC)在神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)環(huán)境的調(diào)控下

3、可對因缺血損傷而造成的神經(jīng)功能喪失產(chǎn)生代償和修復作用。而巢蛋白(neuroepithelialstemcellprotein，Nestin)作為一種在神經(jīng)干細胞中特異表達的類中間絲蛋白，在發(fā)育過程中的神經(jīng)胚胎形成階段、在神經(jīng)內(nèi)皮干細胞中特異性、一過性表達，神經(jīng)前體細胞在進行神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的終末分化之后表達下調(diào)，并立即表達神經(jīng)絲(neurofilament,NF)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。因此,Nestin被認為是神經(jīng)前體細胞

4、的標志，已廣泛用于NSC的鑒定。因此，探討腦缺血損傷后Nestin陽性細胞的形態(tài)、分布、數(shù)目的時程變化，有助于了解腦缺血后的神經(jīng)修復機制。BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞增殖周期的S期作為底物參與DNA的合成，嵌入細胞核DNA中，可被用于細胞增殖的標記。因而BrdU陽性細胞可被看作是具有增殖活性的細胞。本實驗采用大鼠缺血再灌注損傷(MCAO)模型，應用免疫熒光雙標方法觀察缺血后3、5、7、14、21以及30d缺血側(cè)室管膜及室

5、管膜下區(qū)(SVZ)、海馬齒狀回(SGZ)神經(jīng)干細胞的增殖分化變化。實驗顯示：大鼠腦缺血再灌注后各個時間段活動較假手術(shù)組減少，體重減輕；免疫組化雙標顯示各時段對照組BrdU陽性細胞主要分布在缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬(以顆粒層和齒狀回更為明顯)、室管膜上皮細胞及室下區(qū)、脈絡叢上皮細胞等；部分BrdU陽性細胞同時呈Nestin染色陽性；隨缺血再灌注時間的延長，熒光強度值增加，其中造模后第7天大鼠海馬顆粒層和齒狀回BrdU陽性細胞熒光強度值最高；第14

6、天時室管膜上皮細胞及室下區(qū)、脈絡叢上皮細胞的BrdU陽性細胞熒光強度值最高；但造模后第21天時，BrdU陽性細胞熒光強度和BrdU+Nestin免疫雙標熒光強度值下降，但仍高于第3天時的強度值。給予通心絡治療后第3天缺血側(cè)海馬、室管膜及室下區(qū)BrdU+Nestin免疫雙標熒光強度值：通心絡大小劑量組、模型對照組及假手術(shù)組間比較有顯著差異(SGZ區(qū)：P＜0.05；SVZ區(qū)：P＜0.05=；通心絡治療后第3、5、7、14、21、30天時海馬

7、、室管膜及室下區(qū)BrdU+Nestin免疫雙標熒光強度值不同時間點間比較有顯著差異(SGZ區(qū)：P＜0.05；SVZ區(qū)：P＜0.05=；其中通心絡大劑量組第3、5、7、14、21、30天時熒光值均高于通心絡小劑量組。通心絡治療5天起，缺血側(cè)海馬區(qū)、室管膜和室下區(qū)神經(jīng)干細胞開始大量增殖，第14天達最高峰，第21天已下降，但神經(jīng)干細胞仍在增殖并持續(xù)到缺血后第30天，而以通心絡大劑量組效果最為明顯。 近年研究表明，神經(jīng)干細胞通過移植或體

8、內(nèi)激活，在所在的微環(huán)境作用下，發(fā)生增殖與分化，在神經(jīng)干細胞的增殖、分化過程中，外源性因素如生長因子、細胞因子等對其具有重要影響。已知在胚胎干細胞中，堿性成纖維生長因子(bFGF)對細胞分化起著不可忽視的作用，bFGF能使分化的細胞保持良好的狀態(tài)，并能誘導胚胎干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。bFGF又是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在維持大腦正常生理功能中發(fā)揮重要作用。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄集合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測了缺血再灌注損傷后bFGFmRNA的

9、變化，結(jié)果顯示：假手術(shù)組幾乎檢測不到bFGFmRNA的表達；大鼠腦缺血再灌注后在病灶對側(cè)僅見bFGFmRNA有少量表達。缺血再灌注模型組病灶側(cè)bFGFmRNA在不同時間段均有表達，bFGFmRNA在造模后第3天開始表達增強，隨缺血再灌注時間的延長，PCR表達增加，其中造模后第5天表達值最高，與其它時間點相比，統(tǒng)計學處理有顯著差異(P＜0.05)；但造模后第14天時，PCR表達值下降；第30天恢復到基線水平。給予通心絡治療后第3天缺血側(cè)b

10、FGFmRNA表達開始增強，通心絡大小劑量組病灶側(cè)、缺血再灌注模型組病灶側(cè)及缺血再灌注模型組病灶對側(cè)間比較有顯著差異(P＜0.05)；通心絡治療后第3、5、7、14、21、30天時bFGFmRNA表達不同時間點間比較有顯著差異(P＜0.05)；表明通心絡治療第3天起，缺血側(cè)神經(jīng)干細胞相關(guān)細胞因子bFGFmRNA表達開始大量增殖，其中造模后第5天最高，第7天已下降，但bFGFmRNA仍有表達并持續(xù)到缺血后第30天。其中通心絡大劑量組第3、

11、5、7、14、21、30天時bFGFmRNA表達與通心絡小劑量組比較無顯著差異。 通心絡是根據(jù)祖國醫(yī)學絡病學說而研制的復方中藥制劑，由人參、蜈蚣、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、赤芍、冰片等組成具有益氣活血、通絡解痙之功效，臨床上有明顯促進神經(jīng)功能康復的功效。通心絡組大鼠缺血側(cè)Nestin陽性細胞于造模后5d開始大量增殖，第14d達最高峰，第21d開始下降，并一直持續(xù)到缺血后第30天。bFGFmRNA表達上調(diào)早于Nestin陽性細胞的

12、大量增殖時間點，bFGF可能為促進Nestin陽性神經(jīng)干細胞增殖的因素之一。此外bFGF還具有神經(jīng)保護作用，抑制細胞凋亡，促進神經(jīng)元軸突的生長，bFGF能減少自由基損害，保護神經(jīng)元，緩解神經(jīng)損傷。因此bFGF是一類有多種生物學活性的蛋白質(zhì)。它的功能涉及到刺激神經(jīng)干細胞增殖和維持其存活，促進成纖維細胞和血管的再生、神經(jīng)保護等許多方面。通心絡對促進缺血再灌注腦損傷大鼠腦神經(jīng)干細胞增殖，大劑量組效果優(yōu)于小劑量組。而通心絡大劑量組第3、5、7、

13、14、21、30d時bFGFmRNA表達與通心絡小劑量組比較無顯著差異。這說明通心絡除了使bFGFmRNA表達上調(diào)以外，還應有其他的機制刺激Nestin陽性細胞的增殖分化(有待進一步研究)，從而實現(xiàn)通心絡對腦缺血再灌注損傷的治療作用。 結(jié)論 1.通心絡能促進缺血再灌注腦損傷大鼠腦神經(jīng)干細胞增殖。 2.通心絡治療5d起，缺血側(cè)海馬區(qū)、室管膜和室下區(qū)神經(jīng)干細胞開始大量增殖，第14d達最高峰，第21d已下降，并可持續(xù)到

14、缺血后第30d。 3.通心絡對促進缺血再灌注腦損傷大鼠腦神經(jīng)干細胞增殖，大劑量組效果優(yōu)于小劑量組。 4.缺血再灌注模型大鼠病灶側(cè)bFGFmRNA在不同時間段均有表達，bFGFmRNA在造模后第3天開始表達增強，其中造模后第5d表達值最高，持續(xù)時間較長，可達30d。 5.通心絡組缺血側(cè)bFGFmRNA表達上調(diào)時間點早于神經(jīng)干細胞大量增殖時間點，bFGF可能為促進Nestin陽性神經(jīng)干細胞增殖分化的因素之一。