1、本文主要分三部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分
　　許旺細(xì)胞的取材、純化和鑒定
　　目的:培養(yǎng)并純化大鼠許旺細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:取新生3-4天 SD大鼠的坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng),采用IV型膠原酶消化的半植塊培養(yǎng)法獲取原代大鼠許旺細(xì)胞;然后用免疫磁珠分選法獲純化許旺細(xì)胞。用S-100抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定許旺細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞純度。
　　結(jié)果:取材后6-8小時(shí)可見(jiàn)到細(xì)胞貼壁,呈現(xiàn)出明顯的梭形

2、,遮光性強(qiáng)。免疫磁珠分選后可獲得了高純度的許旺細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色見(jiàn)到大量的陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性率達(dá)到95％以上。
　　結(jié)論:胰酶和膠原酶聯(lián)合消化法聯(lián)合磁珠分選法可以獲得高純度的許旺細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞來(lái)源。
　　第二部分
　　神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及表達(dá)
　　目的:構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)載體,并檢測(cè)其表達(dá)效率。
　　方法:采用雙酶切法切取人神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因序列,采用PCR

3、法擴(kuò)增,酶切后和載體EGFP-N1連接;感染感受態(tài)大腸桿菌后挑選單克隆菌株,提取質(zhì)粒酶切鑒定證實(shí)為目的質(zhì)粒后進(jìn)行擴(kuò)增。用lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠許旺細(xì)胞,用ELISA法檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:PCR凝膠電泳結(jié)果顯示切取的片段約為750bp左右,和目的基因片段大小相符合;提取質(zhì)粒后雙酶切顯示切取片段和目的基因的大小相符合;轉(zhuǎn)然后24小時(shí)在顯微鏡下可見(jiàn)到明顯的綠色熒光,一周后上清液中NGF的含

4、量較對(duì)照組明顯升高。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建出含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的EGFP-N1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染許旺細(xì)胞后能夠促進(jìn)NGF的表達(dá)。
　　第三部分
　　高表達(dá) NGF的許旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷的療效及其機(jī)制探討
　　目的:觀察高表 NG的許旺細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的效果,并探討其作用的可能機(jī)制。
　　方法:用改良 Allen法制備大鼠脊髓損傷模型,隨機(jī)分為 A、B、C、D四組,A組為轉(zhuǎn)染含 NGF基因的許旺細(xì)胞移植組

5、,B組為許旺細(xì)胞移植組,C組為 PBS對(duì)照組,D組為假手術(shù)組,造模一周后分別用108/ml含有轉(zhuǎn)染 NGF的許旺細(xì)胞的PBS液、108/ml許旺細(xì)胞的PBS液、PBS液注入 A、B、C組大鼠脊髓損傷部位及其上下各5μl。注射后一、二、三、四周分別用BBB評(píng)分法觀察大鼠雙下肢運(yùn)動(dòng)功能,用肌電圖檢測(cè)大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)功能;處死后用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)脊髓損傷部位 Bcl-2和GAP-43的表達(dá)變化。并取轉(zhuǎn)染組的大鼠脊髓組織行縱行切片觀察許旺細(xì)

6、胞的遷移情況。
　　結(jié)果:各時(shí)間點(diǎn) BBB評(píng)分結(jié)果顯示 D組>A組>B組>C組;肌電圖檢測(cè)結(jié)果顯示中樞潛伏時(shí)傳導(dǎo)速度 A、B、C組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P<0.05,中樞波幅 A、B、C組間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05),D組明顯高于其它三組; Bcl-2和GAP-43免疫組化檢測(cè)結(jié)果提示 A>B>C組,D組僅有少量表達(dá)。大鼠脊髓組織縱行切片觀察顯示在脊髓損傷后一周損傷區(qū)有大量的綠色熒光蛋白表達(dá),隨后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)的