1、研究背景：缺氧誘導因子-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),紅細胞生成素(EPO)等的表達,它的活性對維持腫瘤細胞的能量代謝、促進血管生成及抑制細胞凋亡起著重要作用。研究缺氧誘導因子對腫瘤細胞生長和凋亡的影響,對于進一步闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,探索腫瘤治療的新靶點有著重要意義。
　　 目的:通過構(gòu)建HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表達載體,轉(zhuǎn)染細胞來研究

2、HIF-1對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：從乳腺癌細胞MDA-MB-231中提取HIF-1α mRNA為模版,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,PCR擴增HIF-1α目的基因,連接到pMD18-T載體中,測序驗證,雙酶切將HIF-1α轉(zhuǎn)至pcDNA3.1(+)中。采用陽離子脂質(zhì)體法將表達載體轉(zhuǎn)入SK-BR-3細胞,用Western Blot檢測HIF-1α的表達情況,記錄生長曲線,結(jié)合Hoechest凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。

3、r>　　 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR擴增出的特異片段2749bp,基因測序結(jié)果與GeneBank報道的完全一致,表明成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表達載體。質(zhì)粒HIF-1α-pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染SK-BR-3細胞24h后,取出細胞粘片,置于載玻片上,熒光倒置顯微鏡下觀察估計其轉(zhuǎn)染效率約為20％。經(jīng)Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后實驗組SK-BR-3的HIF-1α的表達增強,連續(xù)9天的細胞計數(shù)細