1、目的：結核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是神經(jīng)系統(tǒng)結核病中最常見的疾病，也是死亡率最高的肺外結核病。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結核中，金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)分泌增加，并發(fā)癥和死亡與MMP-9含量有關。但目前對結核桿菌是如何引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細胞的MMP-9過度表達分泌了解不多。本實驗采用結核桿菌H37Rv感染人外周血單個核細胞后的條件培養(yǎng)基刺激人星型膠質(zhì)瘤細胞系U251，了解結核性腦膜炎發(fā)病中腦組織主要細

2、胞MMP-9的表達分泌特點，以及腦組織細胞在調(diào)控MMP-9分泌時的相互作用，以進一步了解結核性腦膜炎的發(fā)病機制。
　　 方法：六孔板按每孔1.0×106接種U251細胞，待細胞貼壁后，予結核分枝桿菌H37Rv按MOI(感染復數(shù)，即細菌：細胞比例)=1、10和100直接感染72h后(M.tb組)，收集細胞上清，Elisa法檢測：MMP-9含量，裂解細胞提取總RNA，RF-PCR檢測MMP-9基因表達。密度梯度離心法分離人外周血單個

3、核細胞(PBMCs)后，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，接種六孔板(1.0×106細胞/孔)，予結核分枝桿菌H37Rv按10:1的感染復數(shù)感染細胞，37℃培養(yǎng)24h后，收集上清，0.2μm濾膜過濾除菌獲得條件培養(yǎng)液，其中感染結核桿菌的單個核細胞培養(yǎng)液為CoMTB組(PBMC+1640+H37Rv)，未感染結核桿菌的單個核細胞培養(yǎng)液為CoMCON組(PBMC+1640)，在不含單個核細胞的1640中孵育結核桿菌的培養(yǎng)液為CoTB組(164

4、0+H37Rv)。以上述條件培養(yǎng)液1:5稀釋，加入到6或24孔板星型膠質(zhì)瘤細胞系U251繼續(xù)培養(yǎng)，ELISA檢測刺激后12h、24h、48h和72h細胞上清的MMP-9含量變化，流式細胞因子試劑盒檢測上述時間點細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12含量變化；收集共培養(yǎng)后72h的細胞，提取總RNA，定量RT-PCR檢測MMP-9和上述炎性細胞因子mRNA表達情況；明膠酶譜法檢測CoMTB組24h、48h

5、、72h和72h CoMCON組、CoTB組MMP-9的活性；Western Blot檢測CoMTB組12h、24h、48h、72h和72h CoMCON組、CoTB組MMP-9蛋白的表達；提取0，0.5h，1h，2h和6h CoMCON組和CoMTB組刺激U251細胞后的胞核蛋白，Western Blot檢測NF-κd3 p65蛋白的表達水平。
　　 結果：①用結核桿菌按MOI=1、10和100的比例感染U251細胞72h后，

6、Elisa法和RT-PCR均未檢測到MMP-9分泌和表達。②ELISA結果顯示CoMTB組MMP-9明顯升高，12h開始升高(400.1±12.6pg/ml)，24h顯著升高(1750.5±120.9pg/m1)，此后持續(xù)生升高至72h(2900.3±108.4pg/m1)，刺激時間越長，濃度越高，而72h CoMCON組和CoTB組MMP-9濃度分別為(70.6±10.4pg/ml、135.6±12.8pg/ml)，差異有顯著統(tǒng)計學意

7、義(P<0.01)。③TNF-α、IL-1β在CoMCON組未檢測到，在CoTB組含量較低(72h分別為114.0±11.7pg/ml、1459.2±221.3pg/ml)，CoMTB組升高最明顯(72h分別為330.8±35.7pg/ml、3165.4±453.2pg/m1)，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，IL-6、IL-8、IL-12在三組上清中均能檢測到，但以CoMTB組升高最明顯(72h分別為1789.6±278.4pg

8、/ml、4311.7±565.4pg/ml、702.7±102.9pg/m1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-10三組均未見升高(均<3.0pg/m1)，無統(tǒng)計學差異。④RT-PCR檢測MMP-9發(fā)現(xiàn)僅在CoMTB組表達，CoMCON、CoTB二組均未表達，在CoMCON組中，TNF-a、IL-1β未表達，在CoTB組中低表達(相對含量0.123±0.08、0.544±0.134)，而在CoMTB組高表達(相對含量0.487±

9、0.119、0.891±0.222)，差異有顯著統(tǒng)計學意義，IL-6、IL-8、IL-12在三組中均表達，但以CoMTB組表達最多，差異有統(tǒng)計學意義，三組中使用IL-10引物均不能通過PCR方法檢出條帶，提示可能IL-10的含量很少。⑤明膠酶譜法結果顯示CoMTB組24h、48h和72h上清均可見一大小為92KDa的空白透亮條帶，與染成藍色的明膠背景對比，且隨刺激時間延長，MMP-9活性增加，而72h CoMCON和COTB組未見條帶。

10、⑥Western-Blot可檢測到CoMTB組24h、48h、72h細胞上清中MMP-9蛋白表達，而CoMCON和CoTB組未檢測到。⑦Western-Blot檢測核蛋白NF-κB p65水平，結果顯示CoMTB組刺激30min后，星型膠質(zhì)細胞NF-κB p65表達開始增加，與CoMCON組相比，1h后增加2倍(P<0.05)，2h時增加5倍(P<0.01)，并持續(xù)升高至6h。
　　 結論：結核桿菌直接刺激人星型膠質(zhì)瘤系U251

11、細胞不能引起MMP-9的分泌和基因表達；而結核桿菌感染外周血單個核細胞后的條件培養(yǎng)基(CoMTB組)刺激U251細胞后能分泌MMP-9，且刺激時間越長，含量越高；不含單個核細胞的結核桿菌條件培養(yǎng)基(CoTB組)和未感染結核桿菌的單個核細胞條件培養(yǎng)基(CoMCON組)刺激星型膠質(zhì)細胞也不會引起MMP-9分泌；CoMTB組顯著引起炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的升高，而抑炎因子IL-10并不升高，并能增加