1、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是指核苷酸長度大于200個堿基的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。起初認為lncRNA不具備生物學功能，但是越來越多的研究證實lncRNA經(jīng)折疊后可以形成特定的空間結(jié)構(gòu)，在表觀遺傳層面、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾層面以及翻譯過程中調(diào)控特定基因的表達，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。已有不少研究證實了肝癌、胃癌、前列腺癌中l(wèi)ncRNA存在異常表達或序列突變，參與腫瘤的增

2、殖、侵襲、轉(zhuǎn)移;并且還可作為腫瘤診斷、分期、預(yù)后的獨立預(yù)測指標。lncRNA在免疫細胞分化、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮重要調(diào)控作用。lnc-DC只在人類樹突狀細胞(Dendriticcells，DC)中特異性表達，通過與轉(zhuǎn)錄因子STAT3(Signal transducer and activator oftranscription3)結(jié)合，促進單核細胞向DC分化，同時增強DC活化T細胞的能力。X染色體上存在許多與機體免疫功能相

3、關(guān)的基因如腫瘤壞死因子a(Tumor necrosisfactor-a，TNF-a)、CD40配體（Cell differentiation ligand，CD40L）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），而長鏈非編碼RNA Xist(X inactive specifictranscript，Xist)參與X染色體失活過程，Xist的序列結(jié)構(gòu)或功能的改變可能導(dǎo)致X染色體上免疫相關(guān)基因的表達異常，這或許可以

4、部分解釋許多自身免疫性疾病中女性易感的現(xiàn)象。
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種以肝內(nèi)中、小膽管損傷導(dǎo)致膽汁淤積，同時患者血清出現(xiàn)疾病特異的抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody，AMA)，并伴有堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma glutamyl transferase，GGT）等生化指標升

5、高為主要特征的器官特異性自身免疫性疾病，好發(fā)于中老年女性，近年來隨著自身抗體檢測的普及和應(yīng)用，發(fā)病率在逐年上升。感染、環(huán)境因素、遺傳因素以及表觀遺傳學因素等均有可能參與PBC的發(fā)病，但具體發(fā)病機制仍不明確。
　　對于lncRNA在PBC中的研究目前還相對較少，無論是肝組織還是外周血中。本課題對PBC患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中l(wèi)ncRNA表達譜的研究可以為P

6、BC的發(fā)病機理提供新的思路，也可以為PBC的臨床診斷、治療提供新的途徑。
　　第一部分:PBC患者lncRNA表達譜芯片分析及RT-PCR驗證
　　本部分研究收集PBC及健康對照組外周抗凝血各30例，分離PBMC，從中各選取4例進行l(wèi)ncRNA表達譜芯片測定，旨在利用芯片篩選出PBC患者PBMC中差異表達的lncRNA，并用RT-PCR驗證芯片結(jié)果。相比健康對照組，PBC組中共發(fā)現(xiàn)749個異常表達的lncRNA，其中541個

7、上調(diào)，208個下調(diào)。230個異常表達的mRNA，其中184個上調(diào)，46個下調(diào)。從差異表達的lncRNA譜中選取6個(uc003xrr、uc010nhz、p1102447、NR_026777、ENST00000442026、ENST00000431157)擴大樣本量驗證芯片結(jié)果的可靠性，結(jié)果這6個差異的lncRNA在PBC組中的表達水平與芯片結(jié)果相符合。
　　第二部分:lncRNA表達譜芯片生物信息學分析
　　本部分主要通過對

8、第一部分得到的749個差異lncRNA進行Cis-/Trans-靶基因的GO(Gene ontology，GO)、Pathway分析，以及構(gòu)建lncRNA與mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)圖，分析這些異常表達的lncRNA參與的細胞功能和信號通路，為進一步探究lncRNA在PBC中的作用機制提供理論基礎(chǔ)，指明研究方向。結(jié)果Cis/trans靶基因pathway分析提示這些差異表達的lncRNA作用的靶基因主要是與細胞凋亡及代謝途徑相關(guān)。NR4A核受

9、體亞家族廣泛參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAKP、NF-KB、PI3K/JNK、Wnt等，調(diào)控細胞凋亡、細胞增殖、細胞遷移、脂質(zhì)代謝、血管形成以及DNA損傷修復(fù)等多種細胞生物學過程?？v觀芯片中各基因的mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，其成員之一NR4A3基因的表達水平下調(diào)0.22倍，P值為0.0082。綜合分析芯片上各位點的表達水平，發(fā)現(xiàn)NR4A3基因下游2萬bp左右的位置處lncRNALOC441461的表達水平與其相反，上調(diào)2.56倍，P值為0.0

10、015。綜合三個權(quán)威數(shù)據(jù)庫的結(jié)果確定LOC446C61為非編碼RNA。在CatRapid網(wǎng)站在線預(yù)測LOC441461與PRC2復(fù)合物結(jié)合的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LOC441461的核苷酸序列第439-554核苷酸位置處存在PRC2復(fù)合物的結(jié)合位點，其中451-552位置處的辨識度高達94％，預(yù)示它們之間極有可能發(fā)生相互作用。因此，我們猜想PBC患者中LOC441461或許通過招募PRC2復(fù)合物，使NR4A3基因啟動子區(qū)甲基化，進而下調(diào)NR

11、4A3基因的表達水平，觸發(fā)一系列生物學效應(yīng)，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分:linc-pbc靶點驗證及功能探究
　　本部分我們檢測了linc-pbc和NR4A3在PBC組、疾病對照組和健康對照組中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在PBC組中這兩者的表達水平與芯片結(jié)果相符，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學意義。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者中l(wèi)inc-pbc及NR4A3的表達模式與PB

12、C類似，而乙肝肝硬化（Hepatitis B virus，HBV）患者中這二者的表達水平與對照組無顯著性差異。設(shè)計siRNA對linc-pbc進行干擾，觀察NR4A3、FOXP3的mRNA以及蛋白表達水平的是否有變化。同時檢測轉(zhuǎn)染siRNA后PBMC的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染針對linc-pbc的siRNA后，PBMC中l(wèi)inc-pbc的水平下降，而NR4A3的mRNA表達水平及蛋白質(zhì)水平均上調(diào)，F(xiàn)OXP3的水平也上調(diào)，這說明linc-

13、pbc可能確實可以通過與PRC2復(fù)合物結(jié)合，抑制NR4A3的表達;而NR4A3表達水平的降低將導(dǎo)致其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性降低，進一步引起下游靶基因FOXP3的表達下調(diào)，導(dǎo)致循環(huán)外周血液及肝臟組織局部具有免疫抑制功能的Treg細胞減少，打破機體免疫耐受平衡狀態(tài)，從而誘發(fā)疾病。但另一方面，轉(zhuǎn)染siRNA后，細胞凋亡水平與陰性對照組并無明顯差異，可能是由于轉(zhuǎn)染的PBMC是從健康人中分離的，而這些健康人的細胞可能存在一定的損傷修復(fù)機制，單獨干擾lin

14、c-pbc雖然可以使NR4A3的表達上升，但可能尚不足以引起明顯的細胞凋亡現(xiàn)象。又或者，NR4A3僅僅促進自身反應(yīng)性T淋巴細胞的凋亡。
　　結(jié)論：PBC患者PBMC中，相對于健康對照組，共發(fā)現(xiàn)749個異常表達的lncRNA，其中541個上調(diào)，208個下調(diào)。230個異常表達的mRNA，其中184個上調(diào)，46個下調(diào)。NR4A3基因的表達水平下調(diào)0.22倍，P值為0.0082。在NR4A3基因下游的lncRNA LOC441461的表達