1、認為缺血預處理的可能作用機制是通過提高HMGCR的酶活力，增加了細胞膜和線粒體膜膽固醇的含量，增強了細胞內源性的抵抗損傷能力，提高了細胞膜Na+—K+—ATP酶活力和減少了線粒體Cyto c釋放，從而避免了細胞的凋亡和壞死，減輕了冷保存損傷。由此，我們設計了如下實驗：我們先對比大鼠正常供肝、冷保存供肝以及缺血預處理過的冷保存供肝的HMGCR的酶活力、細胞膜和線粒體膜膽固醇的含量、細胞膜Na+—K+—ATP酶活力以及線粒體Cyto c等的

2、差別，從中可以得出缺血預處理對以上指標的影響，然后我們再用含有不同濃度HMGCR酶抑制劑—阿托伐他汀的UW液灌注和保存供肝，以抑制HMGCR酶的活力，然后監(jiān)測以上指標的變化。最后我們通過肝組織學檢查和組織TUNEL測定，進一步驗證以上結果。以此驗證我們推斷的缺血預處理保護機制的可能通路。 本課題主要包括兩部分，具體內容如下： 第一部分供肝耐受熱缺血和冷保損傷安全時限的臨床研究 資料與方法： 本研究回顧性分

3、析178例無心跳供體成人肝移植病例，對無心跳供體供肝在常見熱缺血時間條件下耐受冷保存損傷的安全時限以及在常見冷保存時間的條件下耐受熱缺血損傷的安全時限作一探討。研究分兩部分進行： 1.回顧性分析178例受體中142例供肝冷保存時間≤12h的病例的病歷資料，根據(jù)熱缺血時間的差別分為3組：Ⅰ組為5min之內，43例；Ⅱ組為5～10min，77例；Ⅲ組為10～15min，22例。比較3組間肝移植術后谷丙轉氨酶峰值、原發(fā)性移植肝無功能、

4、急性排斥反應、膽道并發(fā)癥、血管并發(fā)癥、感染，以及移植肝存活和受體存活的差異。 2.回顧性分析178例受體中154例供肝熱缺血時間≤10min的病例的病歷資料，根據(jù)冷保存時間不同分為3組：A組：8h之內，58例；B組：8～12h，62例；C組：12～16h，34例。比較3組間肝移植術后谷丙轉氨酶峰值、原發(fā)性移植肝無功能、急性排斥反應、膽道并發(fā)癥、血管并發(fā)癥、感染，以及移植肝存活和受體存活的差異。 結果： 1.3組患

5、者術后均未發(fā)生原發(fā)性移植肝無功能。隨訪時間8～32個月。Ⅱ組術后ALT峰值及感染發(fā)生率顯著高于Ⅰ組；而Ⅲ組術后ALT峰值、膽道并發(fā)癥發(fā)生率、血管并發(fā)癥發(fā)生率及感染發(fā)生率均顯著升高，而移植肝存活率及受體存活率均降低，與Ⅰ組相比差異均有統(tǒng)計學意義。 2.3組病人術后均未發(fā)生原發(fā)性移植肝無功能。隨訪時間8～32個月，B組病人術后僅ALT值高于A組；而C組病人術后ALT值、膽道并發(fā)癥、感染、移植肝存活率及受體存活率與A組相比差異均有統(tǒng)計

6、學意義。 結論： 冷保存時間在12h之內的無心跳供肝能耐受熱缺血的安全時限為10min；同樣，熱缺血時間在10min之內的無心跳供體供肝能夠耐受12h的冷保存損傷，超過此時限，肝移植術后肝功能恢復延遲，肝移植術后膽道并發(fā)癥和感染的發(fā)生率顯著升高，移植肝存活率和受體存活率顯著降低。 第二部分缺血預處理減輕大鼠供肝冷保存操作的機制的實驗研究 材料與方法： 一.大鼠供肝缺血預處理模型建立及實驗分組

7、 模型建立：麻醉成功后將大鼠固定于特制手術臺上，四肢固定，沿腹中線切開進腹后先分離大鼠肝臟周圍韌帶，隨后分離肝門部的肝動脈、門靜脈和膽總管，進行缺血預處理時給予無損傷血管鉗阻斷肝動脈和門靜脈，而不阻斷膽總管。缺血預處理方式是先給予10min的肝門部的肝動脈和門靜脈阻斷，隨后松開無損傷血管鉗復流10min，最后行腹腔動脈灌注。灌注完畢后完整切下大鼠肝臟給予相應的處理。 試驗分組：25只大鼠隨機分為5組，每組5只。第一組為對照組：

8、正常大鼠肝臟，4℃UW液灌注。第二組為冷保存組：灌注后冷保存8h。第三組為缺血預處理組：先給予缺血預處理，灌注后冷保存8h。第四組為阿托伐他汀30μM處理組：先給予缺血預處理，用終濃度為30μM的阿托伐他汀UW液灌注后再放入含30μM的阿托伐他汀UW液中4℃冷保存8h。第五組為阿托伐他汀100μM處理組：先給予缺血預處理，用終濃度為100μM的阿托伐他汀UW液灌注后再放入含100μM的阿托伐他汀UW液中4℃冷保存8h。 二.供肝

9、HMG—CoA還原酶活力測定 —80℃冰箱取出按組分裝的大鼠肝臟，4℃融化，根據(jù)Parker的方法制備HMGCR微粒體，制備好的HMGCR微粒體仍按組分裝，所有操作均在冰上進行。采用購自碧云天公司的試劑盒按Bradford法測定各組HMGCR微粒體的蛋白濃度。取上述含HMGCR微粒體的重懸液，采用NADPH標準曲線測定HMGCR酶活性，HMGCR酶單位活性定義為在37℃、每mg蛋白提取液中每min氧化1.0μmol NADPH的

10、所需HMGCR量。取分裝的上清，采用Western Blotting方法測定HMGCR蛋白表達。 三.供肝肝細胞質膜膽固醇含量和Na+—K+—ATP酶活力測定 取大鼠肝組織約250 mg左右制成細胞質膜混懸液。采用酶法測定細胞質膜混懸液的膽固醇含量。采用無機磷測定法測定細胞質膜混懸液的磷脂含量。采用無機磷測定法測定細胞質膜混懸液Na+—K+—ATPase酶活力。 四.供肝肝細胞線粒體膽固醇含量和細胞色素C的測定

11、 取大鼠肝組織約150 mg左右提取大鼠肝組織線粒體。采用購自碧云天公司的試劑盒按Bradford法測定線粒體的蛋白濃度。采用酶法測定線粒體的膽固醇含量。采用無機磷測定法測定線粒體的磷脂含量。采用無機磷測定法測定細胞質膜混懸液Na+—K+—ATPase酶活力。最后行大鼠肝組織線粒體和胞漿Cyto c Western Blotting測定。 五.供肝肝細胞調亡和壞死病理檢查 取大鼠肝組織制作石蠟切片并進行HE染色制成

12、玻片。由病理科醫(yī)生進行組織學光鏡檢查，根據(jù)Suzuki標準進行評分評價肝臟的冷保存損傷的嚴重程度。石蠟切片進行組織TENEL測定。 結果： 一.動物模型建立及隨機分組結果 建立了穩(wěn)定可靠的大鼠冷保存供肝缺血預處理模型，并利用此模型進行實驗分組，取得大鼠肝臟標本進行相應處理。 二.供肝HMG—CoA還原酶活力測定結果 供肝經(jīng)過8h冷保存后HMGCR活性明顯下降，給予缺血預處理后再給予冷保存，則HMG

13、CR活性則明顯升高；給予缺血預處理同時給予HMGCR抑制劑阿托伐他汀則HMGCR活性則受到明顯抑制，并隨著阿托伐他汀濃度的增加而抑制效應更為明顯。冷保存8h后HMGCR的蛋白表達明顯下降，給予缺血預處理后HMGCR的蛋白表達則明顯上升；而給予缺血預處理的同時給予阿托伐他汀抑制HMGCR的活力，對HMGCR的蛋白表達略有影響。 三.供肝肝細胞質膜膽固醇含量和Na+—K+—ATP酶活力測定結果 大鼠供肝給予8h冷保存后較正常

14、供肝相比，細胞質膜磷脂并無明顯變化，而質膜膽固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力則明顯下降。當給予缺血預處理后，大鼠供肝細胞質膜膽固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力較單純冷保存相比有了明顯的升高，而細胞質膜磷脂無明顯變化。當缺血預處理的同時再給予HMGCR抑制劑阿托伐他汀，則8h冷保存后大鼠供肝細胞質膜膽固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力較單純缺血預處理加冷保存組相比明顯下降。 四.供肝肝細胞線粒體膽固醇含

15、量和細胞色素C的測定結果 大鼠供肝經(jīng)8h冷保存后線粒體膽固醇較正常大鼠肝臟線粒體膽固醇相比明顯下降而磷脂并無明顯的變化。給予缺血預處理后再給予8h冷保存后，膽固醇的含量較單純8h冷保存有了明顯的升高，但磷脂同樣無明顯的變化。如給予缺血預處理及同時給予阿托伐他汀抑制HMGCR活性，則線粒體的膽固醇再次出現(xiàn)明顯下降。同時大鼠肝組織線粒體和胞漿的Cytoc呈現(xiàn)出同樣的變化規(guī)律。即冷保存8h后Cytoc的釋放同正常肝組織線粒體相比有了明

16、顯的升高，而給予缺血預處理后，Cytoc的釋放則明顯減少。給予缺血預處理同時抑制HMGCR活性則Cytoc的釋放再次增加。 五.供肝肝細胞調亡和壞死病理檢查結果 大鼠供肝冷保存8h后，同對照未保存供肝相比，無論是從光鏡的病理評價還是從凋亡的改變來看，都存在明顯的損傷。在冷保存前給予供肝缺血預處理則明顯改善了供肝的損傷。如給予抑制HMGCR活性，即使給予供肝缺血預處理，仍出現(xiàn)明顯的供肝損傷，并隨HMGCR抑制劑濃度的增加而

17、增加。 結論： 1.缺血預處理可以明顯提高HMGCR活力，而阿托伐他汀則可消除缺血預處理升高HMGCR活性的作用；缺血預處理升高HMGCR活力的機制是增加HMGCR蛋白的表達。 2.冷保存損傷可致細胞質膜膽固醇含量下降和Na+—K+—ATPase酶活力的損害，而缺血預處理可以明顯改善細胞質膜的Na+—K+—ATPase酶活力和升高細胞質膜膽固醇。降低細胞質膜的膽固醇的合成，則Na+—K+—ATPase酶活力也明顯