1、食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在我國尤以河北、河南、粵東沿海等地區(qū)高發(fā),具有發(fā)病率高、治愈率差和死亡率高等特點。目前食管癌的主要治療方法有手術(shù)、化療和放療等,雖然近年來隨著診療技術(shù)的提高和治療方法的不斷改進,食管癌病人的生存率及功能恢復(fù)率大為提高,但是療效仍不盡人意。因此對食管癌的發(fā)生機制、診斷和防治研究仍是當(dāng)前腫瘤學(xué)科的熱點課題。
　　 腫瘤是一種基因病,是長期的、多步驟、多階段、多種基因突變積累的結(jié)果。腫瘤惡性生物學(xué)行

2、為包括細胞增殖和凋亡失衡、新生血管的形成及腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。另外腫瘤細胞的無限制增殖能力和演進能力與干細胞的自我更新能力和多能性分化極其類似,這些特點提示腫瘤細胞中可能會存在某些類似胚胎干細胞調(diào)控自我更新的關(guān)鍵基因的異常表達,從而引起單克隆腫瘤細胞的無限制增殖。
　　 干細胞自我更新能力和多能性分化能力的維持是以Nanog、OCT-4和SOX2等轉(zhuǎn)錄因子和PI3K、Wnt和STAT3等信號通路為主構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控的。N

3、anog是調(diào)控、維持調(diào)控干細胞自我更新能力網(wǎng)絡(luò)中的主要成員,也是與OCT-4平行的另一條重要的分子調(diào)控途徑。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因不僅參與胚胎發(fā)育過程自我更新能力的調(diào)節(jié),而且在胚胎性癌、精原細胞瘤等惡性生殖細胞腫瘤中也異常表達,隨著研究的發(fā)展人們在肺癌、胃癌等一些實體瘤內(nèi)也檢測到了Nanog的異常表達且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而有關(guān)Nanog在食管癌中的表達及其與食管癌關(guān)系的研究,迄今國內(nèi)外未鮮見文獻報道。
　　 為

4、探討Nanog在食管鱗癌組織中的表達情況及其與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系,評價Nanog和MDR1之間的關(guān)系并分析Nanog的表達水平對人食管癌細胞生物學(xué)行為的影響。本研究檢測了食管癌組織、癌旁正常組織中Nanog的表達情況,探討了Nanog與食管癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。并構(gòu)建了攜帶NanogmRNA編碼區(qū)全長cDNA序列和siRNA序列的真核表達載體來研究Nanog對食管癌9706細胞增殖、克隆、侵襲及藥物敏感性等惡性生物學(xué)行為的影

5、響；通過裸鼠移植瘤實驗進行體內(nèi)試驗,從多個方面深入探討Nanog對食管癌9706細胞的影響,試圖闡明Nanog的表達在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。
　　 為使Nanog早日應(yīng)用于食管癌臨床診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。本實驗研究共分以下4章。
　　 第一章、Nanog在食管癌組織中的表達及意義研究
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和Western的方法檢測79例食管癌組織和23例癌旁正常組織

6、組織之中Nanog和MDR1的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 食管癌組織Nanog和MDR1陽性表達高于癌旁正常組織,兩種食管組織表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Nanog陽性表達率與食管癌患者病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；MDR1陽性表達率與食管癌患者病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),且食管癌組織中Nanog和MDR1的表達相互之間呈明顯的正相關(guān)(P<0.05)。
　　 第二章、Nan

7、og對食管癌9706細胞生物學(xué)行為的影響及機制研究
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建攜帶人Nanog mRNA編碼區(qū)全長cDNA序列和特異性siRNA序列的真核表達質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染并篩選出陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆。
　　 2.采用MTT和平板克隆法測定Nanog對9706細胞增殖和克隆能力。
　　 3.采用流式細胞術(shù)(FCM)測定Nanog對9706細胞周期和凋亡的情況。
　　 4.采用侵襲小室和凝膠沒譜實

8、驗檢測Nanog對9706細胞侵襲能力和明膠酶活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.pcDNA3.1-Nanog和pSUPER-EGFP-Nanog真核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染9706細胞成功。
　　 2.MTT和平板克隆實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組細胞增殖和克隆能力無明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組細胞增殖和克隆能力明顯增強(P<0.01),而pS

9、UPER—EGFP—Nanog—b組細胞增殖和克隆能力明顯減弱(P<0.01)。
　　 3.FCM結(jié)果顯示:與對照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組各周期細胞比例無明顯差異(P>0.05)；pcDNA3.1-Nanog-3組G0／G1期細胞比例明顯減少(P<0.01),S和G2／M期細胞比例升高(P<0.05),pSUPER-EGFP-Nanog-b組G0／G1期細胞比例明顯升高(P<0.01),S和G2／

10、M期細胞比例減少(P<0.05),同時與各組相比其凋亡率增加。
　　 4.侵襲小室和凝膠酶譜實驗:與對照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組侵襲能力和明膠酶活性無明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組細胞侵襲能力和明膠酶活性升高,而在pSUPER—EGFP-Nanog-b組降低(P<0.01)。
　　 第三章、Nanog對食管癌9706細胞藥物敏感性的影響及機制研究
　　 方法

11、：
　　 1.采用MTT方法檢測順鉑對人食管癌各組9706細胞增殖的影響并計算抑制率。
　　 2.采用FCM檢測順鉑對人食管癌各組9706細胞周期和凋亡率的影響。
　　 3.采用Real-time PCR和Western方法檢測Nanog對970細胞MDR1mRNA和蛋白表達水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示:Nanog可以對抗順鉑誘導(dǎo)的9706細胞的增殖抑制作用,減弱順鉑藥物毒

12、性(P<0.01)。
　　 2.FCM結(jié)果顯示:Nanog可以對抗順鉑誘導(dǎo)的9706細胞細胞G0／G1期周期阻滯和凋亡作用(P<0.01)。
　　 3.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:與對照組相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP組細胞MDR1表達水平無明顯差異(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3組升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b組降低(P<0.01)。

13、
　　 第四章、Nanog對食管癌9706細胞裸鼠移植瘤影響的研究
　　 方法：
　　 1.建立人食管癌裸鼠移植瘤模型。分為對照組、pcDNA3.1-Nanog-3組和pSUPER-EGFP-Nanog-b組。每周測量瘤體大小并繪制腫瘤體積生長曲線。治療終止時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。
　　 2.采用TUNEL法檢測各組裸鼠移植瘤組織中腫瘤細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)(AI)。
　　

14、3.采用Real-time PCR和Western方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中Nanog和MDR1表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.pcDNA3.1-Nanog-3組裸鼠移植瘤體積和重量顯著大于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；pSUPER-EGFP-Nanog-b組裸鼠移植瘤體積和重量顯著小于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.TUNEL結(jié)果顯示pSUPER-EG

15、FP—Nanog-b組裸鼠移植瘤組織中細胞凋亡指數(shù)明顯多于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.pcDNA3.1-Nanog-3組裸鼠移植瘤Nanog和MDR1 mRNA和蛋白表達顯著高于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01):pSUPER-EGFP-Nanog-b組顯著低于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Nanog在食管癌組織中

16、高表達,與食管癌的病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與MDR1的表達相互之間呈明顯的正相關(guān)。
　　 2.Nanog促進食管癌9706細胞的增殖、克隆和侵襲及耐藥能力,當(dāng)抑制其表達時會導(dǎo)致細胞增殖、克隆和侵襲及耐藥能力的減弱,阻滯細胞于G0／G1期,誘導(dǎo)凋亡；其機制與調(diào)控MPP-2和MPP-9分泌及MDR1表達密切相關(guān)。
　　 3.裸鼠移植瘤模型體內(nèi)試驗與體外實驗結(jié)果相似,Nanog可以促進移植瘤的增殖并調(diào)控MDR1的表達來參