1、研究背景:
　　 蚊媒傳染病流行范圍廣,傳播力強,發(fā)病率高,全球每年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病,死亡人數(shù)過百萬。我國已知蚊類18個屬、371個種和亞種,涵蓋瘧疾、登革熱、乙型腦炎、絲蟲病的主要媒介。中國疾病預防控制中心報告顯示我國僅2006年瘧疾發(fā)病就超過6萬例,疫情出現(xiàn)回升,流行性乙型腦炎在近年也出現(xiàn)局部爆發(fā)?？傊?蚊媒傳染病的流行嚴重危害人類生命健康,影響社會的穩(wěn)定,阻礙經(jīng)濟的發(fā)展。媒介蚊蟲防治是控制蚊媒傳染病流行的重

2、要措施。目前,對于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒病毒傳染病尚無特效治療方法或特異性預防手段,而瘧原蟲對傳統(tǒng)藥物抗藥性也逐漸凸顯,媒介控制在預防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突出,而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學界面臨的重要課題。媒介化學防治由于其突出的效果在蚊媒防治中一度占有統(tǒng)治地位,但是隨著傳統(tǒng)上的化學防治所造成的嚴重環(huán)境污染,及蚊蟲耐藥性的產(chǎn)生等弊端的日益顯現(xiàn),蚊蟲的生物防治愈來愈受到人們的青睞。生物防治主要應用蚊蟲病原體

3、、寄生物、捕食物來達到防治效果,或通過轉(zhuǎn)基因蚊作為控制的措施,這就要求對蚊蟲病原體基因組有更好的了解及尋找新的防治策略。
　　 近年隨著RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術的不斷發(fā)展,不僅成為昆蟲基因組功能研究的有力工具,而且開始在害蟲防治上嶄露頭角,如通過飼喂表達dsRNA的作物或食物來沉默特定基因進而控制害蟲,這為害蟲防治領域開辟了一個新的途徑。由此可以想象在蚊蟲的生物防治策略上RNAi將會有很大的發(fā)

4、展空間。但是RNAi在蚊蟲防治應用上卻存在一個重要的瓶頸--就是如何更有效的將RNAi序列注入到細胞中或蚊蟲體內(nèi)。因此,要想應用在昆蟲基因組研究及蚊媒防治上,就需要一種更有效的傳遞機制。
　　 濃核病毒(Densovirus,DNV)屬自主性的細小病毒,主要感染昆蟲綱與甲殼綱的非脊索動物。目前,濃核病毒亞科主要劃分為四屬即:濃核病毒屬(Deflsovirus)、短濃核病毒屬(Brevidensovirus)、黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?

5、Pefudensovirus)、相對病毒屬(Iteravirus)、同時還包括一些暫時未歸類的濃核病毒。蚊濃核病毒(Mosquito densoviruses,MDV)屬短濃核病毒屬,主要包括埃及伊蚊濃核病毒(Aeries aegypti densovirus,AaeDNV))等目前共分離得到16株?？商禺愋缘母腥疚妙?。MDV在外界相對穩(wěn)定,宿主特異性強僅僅感染蚊類,可通過水平傳播與垂直傳播方式在蚊種群內(nèi)擴散。MDV基因組相對簡單,屬小

6、分子DNA病毒,基因組長大約4000nt左右,由左側(cè)的非結(jié)構蛋白NS1、NS2編碼區(qū)與右側(cè)的結(jié)構蛋白VP編碼區(qū)(分別由p7、p60啟動子啟動),以及兩端的重復序列(Inverted repeat sequences,IRS)組成。其全基因組在亞克隆入質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染蚊細胞后,可在細胞內(nèi)表達早期蛋白NS1,通過早期蛋白識別兩側(cè)IRS并通過自身酶的作用將全基因組從載體上脫離,并回復野生性狀。這些特點使MDV在基因工程中具有安全,便于操作等優(yōu)勢,

7、使其具有發(fā)展為RNAi病毒載體巨大的潛在價值。
　　 本研究通過基因工程方法用可以示蹤的GFP蛋白基因代替AaeDNV VP蛋白基因,并在NS與GFP之間插入人工內(nèi)含子,在內(nèi)含子構建以蚊蟲PutativeU6snRNA polymerase Ⅲ(PolⅢ)promoter為啟動子表達的siRNA表達框,來構建重組蚊濃核病毒干擾載體。靶基因選擇的是蚊蟲空泡ATP酶(Vacuolar ATPase,V-ATPase),V-ATP-a

8、se不僅維持蚊蟲正常生理功能還與瘧原蟲等病原體入侵蚊體內(nèi)息息相關。最終將檢測重組病毒載體及重組病毒顆粒在蚊C6/36細胞系與白紋伊蚊幼蟲體內(nèi)的干擾效果并對白蚊伊蚊實驗室株的致死效果進行初步測試。
　　 人工內(nèi)含子可以自主剪切,靶基因干擾序列表達框隨內(nèi)含子剪切而不會影響外顯子的作用,不會造成蛋白改變。另外內(nèi)含子片段很小,而插入的RNAi編碼框整體也很小,如果這種含有內(nèi)含子的編碼框插入到野生病毒的VP或NS蛋白編碼框內(nèi),重組病毒的基

9、因組長度不會影響其包裝效率,而最終使得重組的可自我復制型病毒成為可能,也為我們下一步將基于RNAi的重組病毒發(fā)展為生物殺蟲劑打下了基礎。
　　 目的:構建基于人工內(nèi)含子內(nèi)插入干擾序列表達框的重組AeaDNV干擾載體。驗證人工內(nèi)含子在昆蟲細胞內(nèi)是否可以正常剪切,內(nèi)含子內(nèi)的RNAi干擾載體是否能在白紋伊蚊C6/36細胞內(nèi)與白紋伊蚊幼蟲體內(nèi)干擾相應靶基因V-ATPase,檢測抑制效果。初步測試重組病毒的殺蚊效果。并為最終發(fā)展可自我復制

10、重組蚊濃核病毒奠定基礎。
　　 方法:根據(jù)白紋伊蚊V-ATPase的序列人工合成3對SiRNA序列使用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染C6/36細胞,以β-actin為內(nèi)參,real-timePCR法篩選對V-ATPase有較高抑制效果的siRNA序列。綠色熒光蛋白GFP作為報告基因連接到AaeDNV的非結(jié)構蛋白NSl基因編碼區(qū)C端,構建成質(zhì)粒載體pNSl-GFP,以NSl-GFP融合蛋白的形式,以病毒p7啟動子啟動表達。

11、應用基因重疊延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)獲得人工內(nèi)含子全序列。人工內(nèi)含子5-端剪接點(供位)序列來自人類β-球蛋白基因第一內(nèi)含子,3’-端剪接點(受位)序列來自免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因內(nèi)含子,并在中間引入MluI與NheI限制性酶切位點以便插入靶基因干擾序列表達框。在兩端加入AgeI限制性酶切位點,將人工內(nèi)含子加入到NSl-GFP融合蛋白編碼框位

12、于NSl編碼區(qū)與GFP編碼區(qū)之間。人工合成岡比亞按蚊與埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)啟動子,分別以兩種啟動子,三種siRNA序列構建6種shRNA表達框:P 1/P2+SiRNA(SenSe)+LOOP(tcaagag)+SiRNA(antisense)+Terminator(tttttttt),插入到人工內(nèi)含子內(nèi)相應酶切位點,構建成6種重組病毒RNAi載體質(zhì)粒。將6種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C6/36細胞

13、,分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、60、96 h,real-timePCR檢測目的基因的表達量。分別以上各重組病毒載體以pUCA載體為輔助載體共轉(zhuǎn)染C6/36細胞,獲得重組病毒后感染白紋伊蚊一期幼蟲進行體內(nèi)抑制實驗,感染后5天分別篩選不同感染度的白紋伊蚊幼蟲,提取RNA,real-time PCR檢測目的基因抑制效果。通過不同時間點計數(shù)病毒感染組幼蚊的死亡數(shù)目來測定重組AaeDNV的致死效應。
　　 結(jié)果:成功的構建了靶基因V-A

14、TPase的重組AeaDNV RNAi載體。(1)shRNA表達元件插入到內(nèi)含子內(nèi),以內(nèi)含子內(nèi)表達框的形式進行表達,插入部位外顯子NS-GFP基因表達融合蛋白未受影響,證明人工內(nèi)含子可以在昆蟲細胞內(nèi)正常剪切。(2)重組載體的報告分子GFP有助于我們對shRNA轉(zhuǎn)染和表達水平進行監(jiān)測。(3)有效干擾序列的重組載體質(zhì)?；?qū)亟M病毒在C6/36細胞和白紋伊蚊一期幼蟲內(nèi)對目的基因都有明顯的抑制效果,實驗組的目的基因表達率明顯降低與對照組相比差

15、異顯著(P<0.05)。(4)埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)啟動子所啟動表達的shRNA無論在白紋伊蚊細胞系中還是在活體中比岡比亞按蚊Putative U6snRNA polymeraseⅢ(PolⅢ)啟動子都起到了更好的靶基因抑制效果。(5)實驗室條件下重組病毒對白紋伊蚊有較好的致死率。
　　 結(jié)論:首次以病毒直接感染的方式對蚊蟲進行了RNAi研究。以人工內(nèi)含子中插入目的基因干擾序