PPARγ基因干擾腺病毒載體重組及鑒定.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的：構(gòu)建PPARγ基因干擾腺病毒載體，為PPARγ基因在創(chuàng)傷性腦損傷中的功能研究及分子機(jī)制闡述奠定基礎(chǔ)。
　　方法：針對(duì)人源PPARγ基因設(shè)計(jì)4條siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入LN229細(xì)胞中，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因干擾效果，確定一條干擾效果最好的siRNA鏈用人工合成方式合成兩端帶Sfi酶切位點(diǎn)的shRNA，用Sfi酶切pAd-pSES-HUS質(zhì)粒，用T4連接酶將shRNA連接到pAd-PSES-HUS質(zhì)粒中，用Pm

2、el和EcoRV雙酶切重組質(zhì)粒驗(yàn)證，將正確克隆的穿梭質(zhì)粒用Pmel線性化后轉(zhuǎn)到BJ5183與骨架質(zhì)粒pAdeasy1同源重組成腺病毒質(zhì)粒。Pacl酶切驗(yàn)證，將正確重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中包裝腺病毒，提取病毒顆粒測(cè)定滴度并感染 LN229細(xì)胞，采用RT-PCR和Western-blot驗(yàn)證重組病毒干擾功能。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建pAd-pSES-HUS-PPARγ-shRNA穿梭質(zhì)粒。（2）得到正確同源重組的腺病毒質(zhì)粒。

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