1、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)是世界范圍內(nèi)第五大常見腫瘤，也是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)腫瘤。并且有著進(jìn)展快、術(shù)后復(fù)發(fā)率高以及預(yù)后不良的特點(diǎn)。原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的易于成血管性是導(dǎo)致其預(yù)后不良的最主要因素之一。這種生物學(xué)特性使腫瘤更易于擴(kuò)散，導(dǎo)致毗鄰臟器浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移。從一定程度上講，原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌這種術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)給傳統(tǒng)的放化療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。所以，有必要通過確認(rèn)新的標(biāo)記物來篩選出那些行根治性切除術(shù)后易復(fù)發(fā)的患者。對(duì)他們?cè)俅涡杏行У妮o助治

2、療，這樣能夠更好的提高原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的根治效果，改善患者預(yù)后。
　　 癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1(CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)超家族成員。在一些免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞中均可以檢測(cè)到CEACAM1的表達(dá)。過去的研究發(fā)現(xiàn)，就腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展而言，CEACAM1在不同的惡性腫瘤類型中發(fā)揮著不同的作用。比如，相比正常組織，CEACAM1在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)明顯減少。已有的文獻(xiàn)證實(shí)，在乳腺癌和前列腺

3、癌組織中，CEACAM1對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起著負(fù)調(diào)節(jié)作用，也就是說在這兩種類型的惡性腫瘤中CEACAM1發(fā)揮著抑癌作用。相反的，在正常的肺組織、肺細(xì)胞和黑色素細(xì)胞中鮮有CEACAM1的表達(dá)，而在肺腺癌和黑色素瘤中CEACAM1的表達(dá)似乎可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提示腫瘤預(yù)后不良。以往的文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中CEACAM1表達(dá)水平降低，而CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)缺失提示了腫瘤的不良預(yù)后。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在口

4、腔癌組織中，CEACAM1分為細(xì)胞膜表達(dá)和細(xì)胞漿表達(dá)兩種類型，而CEACAM1不同的表達(dá)類型在腫瘤的微血管生成和微淋巴管生成中發(fā)揮著不同的作用。目前來講，并沒有關(guān)于不同類型的CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道。其不同表達(dá)類型是否也像口腔癌中的CEACAM1一樣在腫瘤的進(jìn)展、血管生成以及預(yù)后中發(fā)揮了不同的作用，更不得而知。
　　 對(duì)于可溶性CEACAM1的研究，目前報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，在健康人外周血清中可檢測(cè)到

5、可溶性CEACAM1的存在。而在膽管性疾病患者外周血清中，則發(fā)現(xiàn)可溶性CEACAM1的水平明顯增高，這包括原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎以及膽管上皮癌。另外最近的研究發(fā)現(xiàn)，相比健康人群，在胰腺癌患者血清中的CEACAM1的表達(dá)水平明顯增高，并且其似乎可以作為診斷胰腺癌的一個(gè)潛在腫瘤標(biāo)記物。Markel等人在黑色素瘤患者的研究中同樣發(fā)現(xiàn)這種可溶性的CEACAM1在患者血清中的表達(dá)水平明顯增高。雖然一些研究者對(duì)血清中可溶性CEACAM1

6、做了一些前期研究。但就目前來講，對(duì)人血清中可溶性CEACAM1的量化仍然沒有一個(gè)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。另外，對(duì)于血清中這種可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)未見有報(bào)道，其在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中起到怎樣的作用也不得而知，這些都需要進(jìn)一步的深入研究。
　　 第一部分：CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)及其意義
　　 研究目的:
　　 本部分主要研究癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1(CEACAM1)在原發(fā)性肝細(xì)

7、胞肝癌中的表達(dá)方式。分析不同的表達(dá)方式與不同臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，以及不同表達(dá)方式和腫瘤微血管生成以及和原發(fā)性肝癌切除術(shù)后預(yù)后之間的關(guān)系。
　　 研究方法:
　　 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)這個(gè)研究協(xié)議。獲取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科97例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤標(biāo)本。
　　 1.CEACAM1和CD34在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)檢測(cè):獲取原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本，制備蠟塊后切片，免疫組化法檢測(cè)CEACAM1

8、以及CD34在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)。
　　 2.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中不同表達(dá)類型的CEACAM1和患者臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析:采用Chi-square檢驗(yàn)對(duì)CEACAM1不同表達(dá)類型各亞組與患者臨床病理資料之間進(jìn)行比較，分析其相關(guān)性。
　　 3.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中不同表達(dá)類型的CEACAM1對(duì)原發(fā)性肝癌患者根治性切除術(shù)后預(yù)后的影響分析:采用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)

9、用于分析原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中不同類型CEACAM1表達(dá)對(duì)原發(fā)性肝癌患者根治術(shù)后無瘤生存期的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在97例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的腫瘤標(biāo)本中有91例標(biāo)本檢測(cè)到CEACAM1的表達(dá)。其中53例為細(xì)胞膜表達(dá)，38例為細(xì)胞漿表達(dá)。
　　 2.在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中CEACAM1表達(dá)類型與原發(fā)性肝癌的腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤有無血管侵犯、腫瘤有無衛(wèi)星灶存在、Edmondson-Steiner分級(jí)、T

10、NM分級(jí)以及腫瘤微血管密度(MVD，以CD34表示)密切相關(guān)(p＜0.05)，而與患者性別、年齡、血清HBsAg陰陽性、血清抗HCV抗體陰陽性、是否存在肝硬化、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平等無明顯相關(guān)性(p＞0.05)。
　　 3.腫瘤標(biāo)本為肝癌細(xì)胞漿型CEACAM1表達(dá)的原發(fā)性肝癌患者3年無瘤生存期(中位生存期=21.5月，3年無瘤生存率26.3％)明顯低于標(biāo)本為細(xì)胞膜型CEACAM1表達(dá)的患者(中位生存期=

11、36月，3年無瘤生存率52.8％)(p=0.005)。多因素分析結(jié)果顯示:CEACAM1胞漿表達(dá)可以作為判斷原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素(p=0.031)。
　　 結(jié)論:
　　 1.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中CEACAM1的表達(dá)存在肝癌細(xì)胞漿型和肝癌細(xì)胞膜型兩種表達(dá)形式。
　　 2.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中CEACAM1細(xì)胞漿表達(dá)和腫瘤進(jìn)展、腫瘤微血管生成以及患者預(yù)后不良相關(guān)。
　　 3.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中

12、CEACAM1細(xì)胞漿表達(dá)可以作為預(yù)示原發(fā)性肝癌易于復(fù)發(fā)的一個(gè)指標(biāo)。并且將來有可能作為原發(fā)性肝癌切除術(shù)后后續(xù)抑制腫瘤新生血管生成治療的一個(gè)新型潛在靶點(diǎn)。
　　 第二部分：可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中的表達(dá)及其意義
　　 研究目的:
　　 研究可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。探討可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝癌患者中表達(dá)的可能作用。
　

13、　 研究方法:
　　 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)這個(gè)研究協(xié)議。獲取50例健康自愿者及山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科124例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者外周血血清;獲取其中26例原發(fā)性肝癌患者腫瘤標(biāo)本。所有患者及健康自愿者均簽訂書面贊同協(xié)議，研究協(xié)議遵守赫爾辛基宣言。
　　 1.可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者及健康人血清中的表達(dá)檢測(cè):獲取健康自愿者及原發(fā)性肝癌病人外周血，制備血清。ELISA法檢測(cè)血清中可溶性CEACAM

14、1的表達(dá)。
　　 2.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中可溶性CEACAM1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析:采用Chi-square檢驗(yàn)對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中可溶性CEACAM1的表達(dá)水平與患者臨床病理資料之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，分析其相關(guān)性。
　　 3.CD34在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)檢測(cè):獲取原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本，制備蠟塊后切片，免疫組化法檢測(cè)CD34在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)。并將其代表的腫瘤微血管密度(M

15、VD)與相應(yīng)患者血清可溶性CEACAM1的表達(dá)水平做相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.與健康人相比，可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中的表達(dá)水平明顯升高(p＜0.05)。
　　 2.在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中，可溶性CEACAM1表達(dá)水平和患者血清HBsAg陰陽性、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、TNM分期、腫瘤有無血管侵犯以及腫瘤微血管密度(MVD，以CD34表示)密切相關(guān)(p＜0.05)。而與患者年齡

16、、性別、有無肝硬化表現(xiàn)、血清抗HCV抗體陰陽性、血清AFP水平、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平以及乙肝病毒DNA定量無明顯相關(guān)性(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在健康人群及原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清中均存在可溶性CEACAM1，而可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝癌患者血清中的水平明顯增高。
　　 2.原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清可溶性CEACAM1表達(dá)水平的增高促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展、增強(qiáng)了腫瘤的侵

17、襲性，而這些可能與可溶性CEACAM1促進(jìn)腫瘤微血管生成有關(guān)。
　　 第三部分：可溶性CEACAM1在成血管中的作用及其機(jī)制
　　 研究目的:
　　 研究可溶性CEACAM1在體外血管生成中的作用及其機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了2段完整肝炎病毒的HepG2肝癌細(xì)胞)和HepG2細(xì)胞(無肝炎病毒轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞)無菌上清制備:5×105個(gè)細(xì)胞接種于10

18、0ml培養(yǎng)瓶，細(xì)胞達(dá)到60％-80％融合后更新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收取上清，每瓶4ml，分裝凍于-80℃保存。
　　 2.肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞CEACAM1表達(dá)的檢測(cè):Real-timePCR檢測(cè)HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞基因水平CEACAM1的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中可溶性CEACAM1的表達(dá)水平。
　　 3.肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞上清體外成血管

19、作用檢測(cè):Matrigel膠(80ul/孔)鋪于96孔板底，37℃孵育30分鐘。人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)懸液加到Matrigel膠上(10000個(gè)細(xì)胞/孔)，根據(jù)HUVECs懸液中加入處理因素的不同分為HepG2細(xì)胞上清組、HepG2.2.15細(xì)胞上清組、HepG2細(xì)胞上清+rhCEACAM1組和HepG2.2.15細(xì)胞上清組-CEACAM1組。孵箱中培養(yǎng)6-8小時(shí)，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 4.人重組CEACAM

20、1蛋白體外成血管作用檢測(cè):在成血管生成實(shí)驗(yàn)體系中，HUVECs懸液中加入不同濃度的人重組CEACAM1蛋白同時(shí)設(shè)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 5.肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞VEGF表達(dá)的檢測(cè):Real-timePCR檢測(cè)HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞基因水平VEGF表達(dá)。ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)水平。
　　 6.CEACAM1成管的信號(hào)通路檢測(cè):在成血

21、管生成實(shí)驗(yàn)體系中，按照分組分別加入信號(hào)通路PI3K抑制劑LY294002和Wortmamin、MEK抑制劑U-0126、JAK3抑制劑ZM39923和NF-kB抑制劑PDTC，作用1小時(shí)后加入人重組CEACAM1(50ng/ml)，孵箱中培養(yǎng)6-8小時(shí)，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.HepG2.2.15細(xì)胞株在基因及蛋白水平的CEACAM1表達(dá)都明顯高于HepG2細(xì)胞株。
　　 2.Hep

22、G2.2.15細(xì)胞株上清成管作用明顯強(qiáng)于HepG2細(xì)胞株上清。
　　 3.HepG2.2.15細(xì)胞株及HepG2細(xì)胞株基因和蛋白水平的VEGF表達(dá)無明顯差異。
　　 4.人重組CEACAM1對(duì)HUVECs細(xì)胞有明顯的促進(jìn)成血管作用，并且具有濃度依賴的特點(diǎn)。
　　 5.PI3K抑制劑對(duì)重組CEACAM1成血管作用有明顯抑制作用，而JAK3抑制劑、MEK抑制劑、NF-kB抑制劑則對(duì)重組CEACAM1成血管作用無明顯抑