1、目的:胃癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要因為之一,是我國常見的惡性腫瘤,占消化道腫瘤的50％～60％,嚴重危害著人類的健康,目前對胃癌的治療仍是以手術(shù)為主,輔以放、化療的綜合治療,雖然療效較過去有了很大的改善,但總體效果仍不能令人滿意。隨著現(xiàn)代腫瘤免疫生物學和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,腫瘤免疫治療中樹突狀細胞的作用成為研究的熱點。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前已知的功能最強的抗原呈提細胞(antigen-presenti

2、ng cell,APC),參與抗原的捕捉、加工、處理和提呈,成熟的DC是唯一能激活幼稚T淋巴細胞(na(i)ve T cell)的抗原呈提細胞,在誘導高效而特異的抗腫瘤細胞免疫中起關(guān)鍵作用。
　　 DC雖然廣泛分布于機體所有組織器官中,但在外周血中含量極少,僅占單核細胞總數(shù)的0.1％-10％,分離純化困難,不能滿足基礎(chǔ)研究和臨床應用的需要,大量擴增高純度DC是其研究的關(guān)鍵。為獲得足夠治療量的樹突狀細胞,近年來,開展了體外多種不同

3、前體細胞沿不同分化途徑誘導擴增DC的研究,包括用人臍血、骨髓和粒細胞集落刺激因子動員后外周血中的造血干/祖細胞或單核細胞體外誘導擴增,已獲得成功。由于樹突狀細胞主要來源于骨髓的CD34+造血干細胞,故從骨髓細胞中分離擴增誘導DC更易成功。本研究就小鼠骨髓樹突狀細胞(bone marrow-deftveddendritic cell,BMDC)制備的相關(guān)流程、添加GM-CSF、IL-4、TNF-α的劑量、時機、孵育時間等進行探究,探索、優(yōu)

4、化體外誘導和擴增小鼠樹突狀細胞的方法,通過形態(tài)學觀察及流式細胞儀行相對特異性表面標志物檢測以鑒定DC的成熟情況,摸索和印證DC體外培養(yǎng)和擴增的方法,提高DC的產(chǎn)量和純度。
　　 DC除了通過特異性腫瘤單克隆抗體(McAb)介導的細胞毒效應,增強殺傷腫瘤細胞的活性,激活并調(diào)控T淋巴細胞的免疫功能,對機體免疫反應發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用外,還具有直接殺傷腫瘤的生物學活性。過去多采用同位素法、染料排斥法及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法等方法檢測

5、DC抗腫瘤細胞的活性,這些方法雖各具優(yōu)點,但都存在一定的局限性,本研究采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定小鼠DC在不同孵育時間、不同效靶比(E:T)時對胃癌細胞的體外殺傷作用。探討樹突狀細胞腫瘤免疫機制,為臨床進一步研究與應用DC進行胃癌的免疫治療提供佐證。
　　 方法:
　　 選取四周齡615小鼠,雌雄各半,處死,無菌條件下收集并純化骨髓細胞,應用小鼠GM-CSF和小鼠IL-4誘導培養(yǎng)骨髓細胞,于第8天加入小鼠TN

6、F-α培養(yǎng)24小時,倒置顯微鏡觀察第1、3、5、7、8、10天DC的形態(tài)、大小、數(shù)量、分布及貼壁情況的變化。用流式細胞儀檢測培養(yǎng)第7天、第10天DC表面標志物CD11c、DC86分子的表達。
　　 將培養(yǎng)11天的樹突狀細胞懸液加入培養(yǎng)12小時的615小鼠胃癌細胞中,DC與胃癌細胞共孵育作為實驗組,其效靶比分別為10:1、20:1、30:1；對照組分別單獨加入胃癌細胞、DC和1640培養(yǎng)液。用MTT比色法分別測共孵育24小時、48

7、小時的OD值,計算DC對胃癌細胞的殺傷活性。
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)采用x2檢驗,p<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1 DC的制備
　　 每只615小鼠能分離出約3×107個骨髓細胞,培養(yǎng)第2天,相差顯微鏡下可見到培養(yǎng)板底部有半貼壁細胞,少量細胞集落形成,簇狀生長,細胞體積小,圓形,細胞無明顯突起,大量細胞貼壁生長,有細胞聚集現(xiàn)象。在細胞因子的刺

8、激作用下這些細胞逐漸增殖,并且胞體逐漸增大,表面顯示出不規(guī)則的突起,但貼壁能力相對下降,換液時輕微的吹打便可使其懸浮。培養(yǎng)第6天,較多細胞呈半懸浮生長,可見大量細胞集落形成,集落部分細胞表面出現(xiàn)毛刺樣突起,并可見少量單個懸浮的典型DC。培養(yǎng)第7天,細胞集落變大,細胞體積增大,周邊刺突明顯,突起粗大、明顯,細胞形態(tài)似星形或梭形。加入TNF-α48小時后絕大部分細胞懸浮,表面顯示出明顯的樹枝狀突起。經(jīng)計數(shù),1只小鼠的骨髓單個核細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)

9、10d后DC的產(chǎn)量約為7×106。
　　 2 DC標志物檢測
　　 分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α48小時后的DC懸液,加入FITC anti-mouse CD11c、PE anti-mouse CD86單抗,避光孵育后,流式細胞儀檢測各組DC表面CD11c、CD86的表達情況,將加入TNF-α前后組作為實驗組,將未加抗體的DC作為對照組,結(jié)果顯示,CD11c陽性表達率加入TNF-α前為:65.09±3.04％

10、,加入TNF-α后為:70.99±1.44％(x2=6.625;p=0.097)；CD86陽性表達率加入TNF-α前為25.80±30％,加入TNF-α后為55.91±2.41％(x2=6.856；p=0.032),CD86陽性表達率加入TNF-α前較加入后高,二者比較差異有顯著性(p<0.05),CD11c的陽性表達率加入TNF-α前后無差別(p>0.05)。
　　 3 DC對胃癌細胞的殺傷活性檢測
　　 成熟DC與6

11、15小鼠胃癌細胞共孵育24小時,用MTT法檢測DC在效靶比分別為10:1、20:1、30:1時對胃癌細胞的殺傷活性分別為:22.62±2.94％、45.75±1.48％、74.24±0.34％,三組之間比較DC對胃癌細胞的殺傷活性有顯著性(x2=13.997；p=0.036),并隨效靶比的增高而增高；共孵育48小時DC對胃癌細胞的殺傷活性分別為:28.32±3.27％、50.77±0.53％、79.90±2.65％,三組之間比較DC的殺

12、傷活性有顯著差別(x2=13.420；p=0.037)；共孵育24小時各組與48小時各等效靶比組間比較無差別。對照組中DC、胃癌細胞、1640培養(yǎng)液之間比較差異無顯著性(p>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1提取純化小鼠骨髓細胞,經(jīng)細胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α的刺激誘導產(chǎn)生的DC,經(jīng)形態(tài)學觀察及流式細胞儀表面標志物檢測,證實數(shù)量較大、純度較高,此方法穩(wěn)定可靠。
　　 2 MTT比色法測不同效靶比、