1、目的：本課題主要探討人類臍血造血干細胞(Hematopoiefic Stem Cell，HSC)向淋巴系祖細胞(Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL)增殖過程中HOXC4、HOXC6基因表達的情況，并且用人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)和/或全反式維甲酸(all-aans-retinoicacid，ATRA)進行干擾，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fl

2、uorogenicquantitive reverse transcription polymerize cham reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR)方法，以探討HCMV、ATRA在此過程中對HOXC4、HOXC6基因的影響，在基因水平探討HCMV感染導(dǎo)致臍血淋巴系祖細胞損傷的機制。 方法： 1．12例臍血標本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2．實驗分組。實驗分4組： (1

3、)空白對照組：不加病毒液，代之等量1640培養(yǎng)基加入基本培養(yǎng)體系。 (2)HCMV組：HCMV-AD169滴度為組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(tissue culture infectious，TCID50)10-4.5/0.1ml，按100TCID500.1ml感染培養(yǎng)體系。 (3)HCMV+ATRA組：同時加入HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml及ATRA 0.1ml，終濃度同上。(4)ATRA組：加入ATRA稀釋液0.1

4、ml，終濃度6×10-8mol/l。 3.采用造血祖細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細胞，觀察正常組、HCMV-AD169組、ATRA+HCMV組、ATRA組的人類造血干祖細胞經(jīng)植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA-M)誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天的淋巴系祖細胞集落生成情況。 4．采用瑞-姬染色法鑒定CFU-TL集落細胞成分。 5．不同時間點

5、即第3天、第7天、第12天分別提取各組細胞RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。 6．將抽提到的各時間點，不同分組細胞通過隨機引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR技術(shù)檢測臍血淋巴系祖細胞增殖分化過程中各組HOXC4、HOXC6基因的表達。 7．通過電泳實驗分別獲得HOXC4、HOXC6在3天、7天、12天電泳圖。 8．統(tǒng)計方法：結(jié)果用RNA表達相對量(2-△△Ct)表示HOX4

6、、HOXC6基因相對表達量，采用均數(shù)加減標準差(-X±S)表示HOX4、HOXC6基因的變化情況。進行方差齊性檢驗，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。由統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS14.0完成。 結(jié)果： 1．集落細胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞-姬染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系祖細胞。 2．1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結(jié)構(gòu)完整，無明顯降解。

7、 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增三組均有目的基因HOXC4、HOXC6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴增產(chǎn)物大小分別為：HOXC4為254個堿基(bp)，HOXC6為212 bp，GAPDH基因為141 bp，與預(yù)定理論值大小符合。 4．隨時間推移，正常對照組、HCMV組、 ATRA組、及HCMV+ATRA組，HOXC4、HOXC6基因均在增殖分化的第7天表達最強烈，第12天表達明顯減弱。

8、 5．各組中HOXC4基因表達量高于HOXC6組。 6．與正常對照組比較，HOXC4、HOXC6基因受ATRA(6×10-8mol/L)的上調(diào)，而HOXC4、HOXC6基因受HCMV下調(diào)。 7．與HCMV組比較，ATRA有抑制HCMV所致的HOXC4、HOXC6基因的下調(diào)作用。 結(jié)論： 1．HOXC4、HOXC6基因在臍血淋巴系祖細胞中呈現(xiàn)規(guī)律的表達，提示HOXC4、HOXC6均與淋巴系造血有密切的相關(guān)

9、性。 2．人類造血干細胞向淋巴系祖細胞增殖分化過程中，正常對照組、HCMV組、 ATRA組、及HCMV+ATRA組的HOXC4、HOXC6呈規(guī)律表達，第3天少量表達，第7天表達最強烈，第12天表達明顯下降。 3．HOXC4基因在人類造血干細胞向淋巴系祖細胞的正常增殖分化過程中表達均較HOXC6強烈，說明HOXC4是淋巴系祖細胞中的主要基因之一。 4．HCMV能使HOXC4、HOXC6基因表達下調(diào)，提示HCMV可能