1、頭頸部鱗狀細胞癌是威脅人類健康的主要腫瘤之一，已成為全球第六大好發(fā)性腫瘤，每年約有逾50萬病例發(fā)生，且惡性程度高，已成為第五大致死腫瘤1。每年的死亡數(shù)約為14，000例，約占全部腫瘤診斷病例的6％2。根據(jù)American Cancer Society數(shù)據(jù)顯示，盡管隨著外科技術(shù)水平的提高和放療化療方案的成熟，在1996-2003年間，其死亡率已顯著降低，但是，其復發(fā)和轉(zhuǎn)移病例的術(shù)后存活時間僅為6個月。而這其中，導致低存活率的主要因素就是區(qū)

2、域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠處臟器轉(zhuǎn)移。因此針對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因研究成為腫瘤研究的熱點之一。
　　 熱休克蛋白27(heat shock protein，Hsp27)是小分子量熱休克蛋白家族中最具代表性的成員，其重要的生物學功能是保護細胞免受環(huán)境中自由基、熱、缺血和毒性物質(zhì)等各種應激因素導致的損傷，促進蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝和糾正蛋白質(zhì)的錯誤結(jié)構(gòu)。此外，Hsp27也參與微絲的穩(wěn)定，細胞增殖、分化、及細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)等5-7。

3、
　　 有報道顯示Hsp27與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其作為一種應激蛋白，在腫瘤中的表達程度與腫瘤分期及預后有一定的相關(guān)性。但有研究發(fā)現(xiàn)Hsp27在某些腫瘤中過表達；而同時在某些腫瘤中低表達或無表達8，9。如在前列腺癌10，人肝細胞肝癌11，12，腎細胞癌13，口腔舌鱗癌14及乳腺癌15，胃癌16，17中，Hsp27均呈高表達狀態(tài)，并被認為是預后不良的標志性因子。同時有諸多研究的結(jié)果與以上研究截然相反，顯示Hsp27是預后良好

4、的標志性因子，在諸多患有惡性纖維素瘤15，成神經(jīng)細胞瘤18，子宮內(nèi)膜腺瘤19，20和食道癌的患者中，都有報道認為Hsp27高水平表達預示預后良好。也有更多的研究支持，即使對同一病理分型的腫瘤進行有關(guān)Hsp27的研究，其與腫瘤惡性性及轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)系也不完全一致；此外，不同組織來源的腫瘤，不同個體間，也存在同樣現(xiàn)象。因此，目前，對于Hsp27的研究，尤其Hsp27與頭頸部鱗狀細胞癌的關(guān)系尚無定論。
　　 本課題中使用美國密歇根大學

5、腫瘤中心Thomas E.Carey實驗室建立并保存的來自同一病人原發(fā)腫瘤和同期存在的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的兩種細胞系UM-SCC-22A/UM-SCC-22B，首先分別運用MTS，細胞劃痕試驗，Matrigel細胞侵襲實驗及裸鼠活體內(nèi)生物發(fā)光技術(shù)，觀察此兩種細胞系生物學行為的異同，發(fā)現(xiàn)相對于低轉(zhuǎn)移潛能頭頸鱗癌細胞系UM-SCC-22A，高轉(zhuǎn)移潛能頭頸鱗癌細胞系UM-SCC-22B表現(xiàn)出極強的遷移和侵襲特性。即，來源于同一病患同期原位癌和淋巴結(jié)

6、轉(zhuǎn)移灶的兩種細胞系，在體內(nèi)外轉(zhuǎn)移生物學行為上存在著顯著差異，可被用于進行頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移行為的研究模型。而且，在此模型中我們發(fā)現(xiàn)其兩者的Hsp27mRNA和蛋白水平表達存在顯著性差異，即，UM-SCC-22A低表達Hsp27，同時，UM-SCC-22B高表達Hsp27，因此，我們將此實驗模型用于進行Hsp27在頭頸鱗癌遷移和侵襲中的作用研究，以期能夠揭示兩者之間的關(guān)系。
　　 作為一種新的基因治療方法，RNA干擾(RNA inter

7、ference，RNAi)以其特異性、高效性成為研究的熱點。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應等優(yōu)點，已成為當前基因治療中的理想載體。活體內(nèi)熒光示蹤系統(tǒng)的應用也拓展了腫瘤轉(zhuǎn)移動物實驗模型的建立思路，尤其通過裸鼠左心房內(nèi)注射腫瘤細胞所建立的腫瘤轉(zhuǎn)移動物實驗模型，相對于鼠尾注射，皮下注射、原位注射等操作，具有成瘤率高、成瘤速度快、動物存活率高并且可以更好的模擬腫瘤細胞定植

8、、侵襲、轉(zhuǎn)移過程等優(yōu)點，已逐漸發(fā)展成為成熟且被廣泛應用的腫瘤轉(zhuǎn)移動物實驗模型。
　　 在本課題中，我們利用RNAi干擾技術(shù)，設計并合成針對頭頸部鱗狀細胞癌細胞Hsp27基因的小干擾RNA片段，通過陽離子脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染Hsp27過表達腫瘤細胞，同時，購買已建立的載有特異性抑制Hsp27基因表達的小發(fā)夾RNA的慢病毒質(zhì)粒，包裝生產(chǎn)慢病毒顆粒，長效轉(zhuǎn)染Hsp27過表達腫瘤細胞；此外，設計構(gòu)建生產(chǎn)過表達Hsp27基因的慢病毒顆粒，長效轉(zhuǎn)

9、染Hsp27低表達腫瘤細胞。運用MTS，細胞劃痕，Matrigel細胞侵襲實驗等觀察體外實驗中腫瘤細胞相應的遷移和侵襲能力改變，并同時通過建立裸鼠活體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移生物發(fā)光模型，觀察Hsp27基因沉默/過表達后，腫瘤細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。以期進一步研究頭頸部鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移機制，及其與Hsp27表達之間的關(guān)系，探討抑制頭頸部鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移的策略，同時探索頭頸部鱗狀細胞癌基因治療的靶點。
　　 本課題包括四部分
　　 第一

10、部分：不同轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞株(UM-SCC-22A/UM-SCC-22B)生物學行為異同及Hsp27mRNA和蛋白的表達
　　 1.不同轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞株生物學行為異同
　　 對2種已知轉(zhuǎn)移潛能的頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22A/UM-SCC-22B進行常規(guī)培養(yǎng)，采用MTS細胞增殖實驗，細胞劃痕實驗及transwell侵襲實驗，建立裸鼠活體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移生物發(fā)光模型，觀察不同轉(zhuǎn)移潛能細胞系的

11、轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果顯示：常規(guī)接種細胞培養(yǎng)24、48小時后，此兩種細胞系增殖能力無明顯差異(P>0.05)。細胞劃痕試驗表明，劃痕產(chǎn)生48小時后，UM-SCC-22B細胞系劃痕愈合率達66.50％，UM-SC-22A僅為18.69％，即UM-SCC-22B細胞體外遷移能力為UM-SCC-22A的3.56倍。Matrigel侵襲實驗顯示，接種105細胞于上室40小時后，UM-SCC-22B細胞系有53.56個細胞/觀察視野穿透Matrigel，

12、粘附于上室底膜下表面，UM-SCC-22A細胞系有25.45個細胞/觀察視野，即UM-SCC-22B細胞體外侵襲能力為UM-SCC-22A的2.11倍。生物發(fā)光顯示，UM-SCC-22B組細胞裸鼠左心房接種后，成瘤率和轉(zhuǎn)移率明顯高于UM-SCC-22A組。
　　 2.不同轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞株中Hsp27mRNA和蛋白的表達
　　 對通過體內(nèi)外實驗證實，具有不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22A

13、/UM-SCC-22B進行常規(guī)培養(yǎng)，采用實時熒光定量PCR和Western blotting方法對Hsp27基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達進行檢測，分析其表達豐度與頭頸部鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。實驗發(fā)現(xiàn)，2種頭頸部鱗狀細胞癌細胞系均有Hsp27基因表達，高轉(zhuǎn)移潛能細胞系UM-SCC-22B中Hsp27表達水平明顯高于UM-SCC-22A，差異顯著(P<0.01)。UM-SCC-22B細胞系Hsp27 mRNA水平是UM-SCC-

14、22A的22.38倍，western blotting結(jié)果顯示UM-SCC-22B細胞中，位于27kb位置條帶明顯強于UM-SCC-22A。頭頸部鱗狀細胞癌細胞系Hsp27表達豐度與其轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，隨著轉(zhuǎn)移能力的上升，Hsp27表達水平升高。
　　 第二部分：瞬時轉(zhuǎn)染siRNA干擾Hsp27基因效果鑒定及其對UM-SCC-22B遷移和侵襲的影響
　　 1.siRNA干擾：Hsp27基因及其干擾效果鑒定
　　 根據(jù)

15、siRNA設計原則，設計合成靶向Hsp27基因的siRNA，采用陽離子脂質(zhì)體試劑瞬時轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22B，應用實時熒光定量PCR和Western Blotting檢測RNA干擾后Hsp27基因的沉默效果。結(jié)果顯示，siRNA Hsp27瞬時轉(zhuǎn)染24小時后，Hsp27 mRNA水平明顯下調(diào)，其干擾效率為93％，與空白對照組及陰性對照組比較，差異具有顯著性(P<0.01)。siRNA Hsp27瞬時轉(zhuǎn)染4

16、8小時后，Hsp27蛋白水平明顯下調(diào)，western blotting結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，位于27kb位置條帶明顯強度明顯下降，與實時熒光定量PCR結(jié)果一致。
　　 2.siRNA干擾Hsp27基因?qū)︻^頸部鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響
　　 于轉(zhuǎn)染siRNA后48小時，應用細胞劃痕試驗檢測Hsp27基因表達下調(diào)后，高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞UM-SCC-22B遷移能力變化；應用Matrigel侵

17、襲實驗檢測Hsp27基因表達下調(diào)后，UM-SCC-22B侵襲能力的改變。轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)UM-SCC-22B細胞Hsp27基因表達后，細胞劃痕后24小時，空白對照組和陰性對照組細胞劃痕開始愈合，而siRNA轉(zhuǎn)染組幾乎沒有愈合；72小時后空白對照組和陰性對照組愈合率達71.66％，50.57％，而siRNA轉(zhuǎn)染組僅有少量愈合，愈合率為18.30％，與其它兩組比較差異顯著(P<0.01)。Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示，接種上室40小時

18、后，siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細胞數(shù)明顯減少，每個觀察視野僅有26.91個細胞，是空白對照組穿膜細胞數(shù)的50.24％，此結(jié)果與空白對照組和陰性對照組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。
　　 第三部分：Hsp27基因shRNA慢病毒靶向沉默Hsp27的效果鑒定及對UM-SCC-22B生物學行為的影響
　　 1.Hsp27基因shRNA慢病毒載體的鑒定及其靶向沉默熱休克蛋白27的效果鑒定
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19、ystem，可表達shRNA Hsp27的慢病毒載體質(zhì)粒pLK0.1-shRNA-Hsp27質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入UM-SCC-22B細胞，運用實時熒光定量PCR檢測Hsp27表達，初步鑒定質(zhì)粒正確性和有效性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24，48小時后，Hsp27 mRNA表達量分別降至42％，24％，干擾效果明顯。密歇根大學載體中心包裝后，得到高滴度慢病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27，長效轉(zhuǎn)染入UM-SCC-22B后，運用實時熒光定量PCR和w

20、estern blotting檢測Hsp27表達。結(jié)果顯示，shRNA Hsp27長效轉(zhuǎn)染后，Hsp27 mRNA水平明顯下調(diào)，其干擾效率為94％，與空白對照組及陰性對照組比較，差異具有顯著性(P<0.01)。Hsp27蛋白水平明顯下調(diào)，western blotting結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，位于27kb位置條帶明顯強度明顯下降，與實時熒光定量PCR結(jié)果一致。
　　 2.Hsp27基因shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后對頭頸

21、部鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響
　　 慢病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27長效轉(zhuǎn)染UM-SCC-22B，并高效干擾Hsp27表達后，采用MTS細胞增殖實驗，細胞劃痕實驗及Matrigel侵襲實驗，建立裸鼠活體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移生物發(fā)光模型，觀察Hsp27表達抑制后，UM-SCC-22B轉(zhuǎn)移能力變化。結(jié)果顯示：常規(guī)接種細胞培養(yǎng)24、48小時后，與空白組和陰性對照組相比，shRNA Hsp27組增殖能力無明顯差異(P>0.05)

22、。細胞劃痕試驗表明，劃痕產(chǎn)生72小時后，空白對照組細胞劃痕愈合率達71.4％，shRNA Hsp27實驗組僅為16.3％，即shRNA Hsp27干擾后，空白組細胞遷移能力為實驗組4.38倍。Matrigel侵襲實驗顯示，接種105細胞于上室40小時后，shRNA Hsp27實驗組有29.6個細胞/觀察視野穿透Matrigel，粘附于上室底膜下表面，空白對照組細胞有60個細胞/觀察視野，即空白組細胞體外侵襲能力為shRNA asp27組

23、的2.03倍。熒光示蹤顯示，各組細胞裸鼠左心房接種后，空白組動物模型成瘤率和轉(zhuǎn)移率明顯高于實驗組。
　　 第四部分：重組Hsp27表達慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及其對頭頸部鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響
　　 1.重組Hsp27表達慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定
　　 設計引入BamHI，Xbal兩個酶切位點的人Hsp27基因引物，利用pOTB7-Hsp27全長cDNA質(zhì)粒，PCR擴增Hsp27基因，平端酶切，回收純化。利用

24、BamHI，Xbal酶切位點，T4連接酶連接Hsp27基因片段和pLentiLox RSV慢病毒載體。雙酶切電泳驗證目的Hsp27基因片段連接正確，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5-alpha大腸桿菌，小提后進行重組質(zhì)粒基因測序。測序正確，成功構(gòu)建過表達Hsp27基因慢病毒載體pLenti-RSV-Hsp27。大提后送密歇根大學載體中心包裝生產(chǎn)過表達Hsp27慢病毒顆粒pLenti-RSV-Hsp27。長效轉(zhuǎn)染入低轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-S

25、CC-22A后，實時熒光定量PCR和westernblotting檢測Hsp27表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，Hsp27基因mRNA和蛋白水平均明顯升高。過表達組Hsp27 mRNA水平是對照組的15.07倍，western blotting結(jié)果顯示，過表達組27kb蛋白條帶強度顯著增高。
　　 2.過表達Hsp27對頭頸部鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響
　　 慢病毒顆粒plenti-RSV-Hsp27長效轉(zhuǎn)染UM-SCC-2

26、2A，并高效表達Hsp27表達后，采用MTS細胞增殖實驗，細胞劃痕實驗及Matrigel侵襲實驗，建立裸鼠活體內(nèi)熒光示蹤腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型，觀察Hsp27表達增加后，UM-SCC-22A轉(zhuǎn)移能力變化。結(jié)果顯示：常規(guī)接種細胞培養(yǎng)24、48小時后，與空白對照組相比，過表達Hsp27組增殖能力無明顯差異(P>0.05)。細胞劃痕試驗表明，劃痕產(chǎn)生48小時后，空白對照組細胞劃痕愈合率為19.84％，過表達Hsp27實驗組為51.33％，即Hsp2

27、7過表達后，細胞遷移能力為空白對照組2.56倍。Matrigel侵襲實驗顯示，接種105細胞于上室40小時后，Hsp27過表達組有59.13個細胞/觀察視野穿透Matrigel，粘附于上室底膜下表面，空白對照組細胞有29.35個細胞/觀察視野，即過表達組細胞體外侵襲能力為空白對照組的2.01倍。熒光示蹤顯示，各組細胞裸鼠左心房接種后，過表達組動物模型成瘤率和轉(zhuǎn)移率明顯高于對照組。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立頭頸部鱗

28、狀細胞癌轉(zhuǎn)移細胞實驗模型，建立頭頸部鱗狀細胞癌裸鼠活體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移生物發(fā)光模型。
　　 2.頭頸部鱗狀細胞癌Hsp27的表達與其轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，隨其轉(zhuǎn)移潛能的升高，其表達豐度升高。頭頸部鱗狀細胞癌低轉(zhuǎn)移潛能細胞系UM-SCC-22A/高轉(zhuǎn)移潛能細胞系UM-SCC-22B，可作為良好的實驗模型，深入研究Hsp27表達調(diào)控與頭頸部鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移間的關(guān)系。
　　 3.體外合成，瞬時轉(zhuǎn)染siRNA干擾技術(shù)可高效下調(diào)高轉(zhuǎn)移潛能頭頸

29、部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22B asp27基因的表達。
　　 4.瞬時轉(zhuǎn)染siRNAHsp27，高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系Hsp27基因下調(diào)后，顯著抑制其細胞遷移和侵襲能力。Hsp27基因可作為有效頭頸部鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移的治療靶點。
　　 5.長效轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27能夠高效、特異的沉默高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22B的Hsp27基因表達。
　　 6.

30、長效轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27可顯著抑制高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22B的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移能力。
　　 7.成功構(gòu)建過表達Hsp27基因慢病毒載體pLenti-RSV-Hsp27。長效轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒pLenti-RSV-Hsp27可高效、特異性增加低轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UM-SCC-22A的Hsp27基因表達。
　　 8.長效轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒pLenti-RSV-Hsp27可