1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是人類在2l世紀(jì)初遭遇的烈性傳染病之一，我國(guó)為該病的重要疫區(qū)。其病原體為SARS冠狀病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)。目前對(duì)其尚無(wú)特效的治療方法，因而探索有效的抗SARS病毒新途徑勢(shì)在必行。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是基于RNA水平的抗病毒策略，憑借自身的特異、高效、快速等優(yōu)勢(shì)，它已成

2、為抗病毒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。RNAi的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為治療SARS病毒感染提供了新思路。 本研究擬開(kāi)展以下兩方面內(nèi)容，觀察siRNA對(duì)SARS病毒復(fù)制的抑制作用。探索抗SARS病毒感染的新途徑。 一.siRNA的設(shè)計(jì)合成及其對(duì)SARS病毒部分復(fù)制酶基因的抑制作用 由于復(fù)制酶基因的表達(dá)是SARS病毒啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的前提，而刺突蛋白在病毒入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此選擇SARS病毒復(fù)制酶基因(rep)和刺突蛋白基因

3、(s)的保守序列作為靶基因，設(shè)計(jì)并合成9種siRNA(pS01～09)，其中pS01～07針對(duì)rep基因，pS08～09針對(duì)s基因。由于體外合成的siRNA不易操作且基因干涉作用持續(xù)時(shí)間短，故采用構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的方法在體內(nèi)合成siRNA。 同時(shí)，構(gòu)建融合表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)基因和部分rep基因的重組載體，將已構(gòu)建好的識(shí)別rep基因的siRNA表達(dá)載體與重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析融

4、合基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，針對(duì)SARS病毒rep基因第3504nt-3522nt的siRNA可使rep基因的表達(dá)量下降33％，說(shuō)明siRNA可特異而有效地抑制基因的表達(dá)。 二.siRNA在Vero細(xì)胞中的抗SARS病毒作用 為進(jìn)一步研究siRNA對(duì)SARS病毒復(fù)制的抑制作用，將構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄siRNA的克隆細(xì)胞株V/pS01、03、05～09及對(duì)照細(xì)胞株V/pSN，然后以BJ

5、01株病毒懸液感染克隆細(xì)胞，通過(guò)病毒滴度測(cè)定和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察siRNA對(duì)SARS病毒復(fù)制的抑制作用。結(jié)果表明，針對(duì)rep基因和s基因的siRNA(pS05和pS08)呈現(xiàn)出了良好的抗病毒效果，在接種SARS病毒后均未檢測(cè)到病毒的特異性抗原，且病毒滴度下降103～104倍。另外，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞上清中rep基因的含量，結(jié)果顯示，細(xì)胞株V/pS05中rep基因含量?jī)H為對(duì)照組的1/1000倍。表明rep基因的缺