1、自體皮片移植是治療皮膚創(chuàng)傷的傳統(tǒng)方法，但自體皮源不足是大面積創(chuàng)傷救治過(guò)程中的難題。除自體皮片移植以外，組織工程皮膚為治療皮膚損傷提供了一種來(lái)源充足而有效的治療方法。目前已研制了多種組織工程真皮產(chǎn)品且部分商品經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床。2007年11月第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程實(shí)驗(yàn)中心研究開發(fā)的組織工程皮膚產(chǎn)品通過(guò)國(guó)家鑒定，成為我國(guó)第一個(gè)組織工程產(chǎn)品，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療，為臨床的各種皮膚損傷提供了足夠的可供移植的皮膚來(lái)源。然而由于目前組

2、織工程皮膚產(chǎn)品缺乏血管結(jié)構(gòu)，移植后無(wú)法為組織工程真皮種子細(xì)胞的分裂、增殖提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，即充足的血液供應(yīng)。使其在面積較大和深度皮膚損傷的移植成功率和修復(fù)效果受到一定的影響。所以提高組織工程真皮的血管化對(duì)改善其移植成活率及修復(fù)效果具有重要的意義。
　　本研究從構(gòu)建組織工程所用的種子細(xì)胞、支架材料和緩釋系統(tǒng)等方面出發(fā)對(duì)組織工程真皮的血管化問(wèn)題進(jìn)行了一定的研究。實(shí)驗(yàn)分四部分進(jìn)行，具體內(nèi)容如下：
　　1．作為血管化組織工程真皮

3、種子細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)種子細(xì)胞，通過(guò)倒置相差顯微鏡，免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)第VIII因子相關(guān)抗原的表達(dá)、掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及其排列方式和透射電子顯微鏡觀察Weibel-Palade小體進(jìn)行細(xì)胞鑒定，結(jié)果顯示通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方法所獲得的細(xì)胞為純度較高，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC。
　　2．新生小牛

4、皮I型膠原復(fù)合HUVEC和成纖維細(xì)胞構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的研究
　　通過(guò)種子細(xì)胞HUVEC和人皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblast,Fb)的接觸和非接觸共培養(yǎng)，在二維和三維維條件下探討Fb對(duì)HUVEC形成血管的作用，構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮。
　　將獲得的HUVEC細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，應(yīng)用插入式培養(yǎng)皿進(jìn)行HUVEC與Fb非接觸培養(yǎng)，同時(shí)用Hoechst33342標(biāo)記HUVEC后與Fb按不同比例混合進(jìn)

5、行二維接觸培養(yǎng)，相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察。
　　將第3代HUVEC與Fb按1:1比例混合后復(fù)合膠原（細(xì)胞密度106/ml）進(jìn)行三維培養(yǎng)，構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，HE染色觀察。HUVEC與混合后復(fù)合膠原（細(xì)胞密度106/ml）進(jìn)行三維培養(yǎng)構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，HE染色觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在二維和三維條件下Fb均可促進(jìn)HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu),本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮。
　　3．豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)復(fù)

6、合HUVEC構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的研究
　　通過(guò)改良方法制備高空隙率豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(Acellulardermalmatrix,ADM)，將其作為組織工程真皮支架材料復(fù)合HUVEC和Fb進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討作為組織工程支架材料的ADM在構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的作用及應(yīng)用。
　　利用改良的胰酶-膠原酶雙重消化法制備高空隙率ADM，通過(guò)HE染色、掃描電鏡和強(qiáng)度測(cè)試儀對(duì)ADM進(jìn)行觀察測(cè)定，結(jié)果顯示ADM具有較高空隙率

7、和較大的斷裂強(qiáng)度。
　　ADM分別復(fù)合Fb和HUVEC進(jìn)行共培養(yǎng)測(cè)定ADM的細(xì)胞相容性，同時(shí)將HUVEC（106/ml）注入ADM大空隙中體外培養(yǎng)，通過(guò)HE染色和掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示以ADM為支架材料復(fù)合HUVEC可體外構(gòu)建含有血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮。
　　動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以無(wú)細(xì)胞ADM作為對(duì)照組，復(fù)合HUVEC的ADM作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)，HE染色結(jié)果顯示移植后2W，無(wú)血管形成，移植后3W，對(duì)照組無(wú)血管

8、形成，而實(shí)驗(yàn)組有大量血管樣結(jié)構(gòu)形成，抗人CD31單克隆體和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色為陽(yáng)性，表明在體外由ADM復(fù)合HUVEC構(gòu)建的是含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮，動(dòng)物體內(nèi)移植后參與血管形成，提高組織工程真皮移植后血管形成速度，進(jìn)而提高移植后的成功率。
　　4．明膠緩釋微球系統(tǒng)促進(jìn)組織工程皮膚血管化的研究
　　細(xì)胞因子堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bisicfiberoblastgrowthfactor,bFGF）在血管發(fā)生和再生過(guò)程中

9、發(fā)揮非常重要的作用，在適當(dāng)?shù)臐舛认驴梢源龠M(jìn)新生血管的生長(zhǎng)。在體外構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，由于培養(yǎng)液為間斷性定期更換，難以維持培養(yǎng)液中和組織工程真皮深部bFGF濃度的穩(wěn)定。為了保證培養(yǎng)液中bFGF濃度的穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)利用明膠微球緩釋系統(tǒng)復(fù)合bFGF，通過(guò)明膠微球的緩釋作用維持培養(yǎng)液中bFGF濃度的恒定。
　　通過(guò)HUVEC和Fb與明膠微球共培養(yǎng)檢測(cè)明膠微球的生物相容性，體外溶出度測(cè)定方法測(cè)定明膠微球緩釋曲線，利用復(fù)合bFGF的明

10、膠微球混合膠原纖維作為組織工程真皮支架材料，以HUVEC作為種子細(xì)胞，F(xiàn)AD培養(yǎng)液體外共培養(yǎng)構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮；在其他條件相同的情況下，使用未復(fù)合bFGF明膠微球和加入50ng/ml濃度bFGF的FAD培養(yǎng)液作為對(duì)照構(gòu)建組織工程真皮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5d實(shí)驗(yàn)組有血管樣結(jié)構(gòu)形成，而對(duì)照組很少有血管樣結(jié)構(gòu)形成。本實(shí)驗(yàn)提示通過(guò)明膠微球復(fù)合生長(zhǎng)因子可以提高HUVEC形成血管速度，為組織工程組織體內(nèi)移植提高血管再生和長(zhǎng)入速度，進(jìn)而提高移植