1、隨著糖尿病發(fā)病率的不斷提高，近年來對糖尿病并發(fā)癥的研究越來越受到重視。糖尿病動脈粥樣硬化常導致心肌梗塞、腦栓塞等嚴重的心腦血管病變。研究表明2型糖尿病患者的心血管病變不僅其發(fā)生率遠較非糖尿病人為高，且發(fā)病較早、病變較重、進展較快、病死率較高。胰島素C肽是胰島素合成過程中的降解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)C肽是冠心病等心血管疾病的相關因素，可能與糖尿病患者動脈粥樣硬化有關。該研究建立C肽表達載體pGEX-4T-1+C-peptide使C肽在大腸桿菌原核

2、表達，并用于大鼠，觀察C肽對動脈粥樣硬化相關因子的影響。 第一部分 人胰島素C肽的表達和純化 目的 構建人胰島素C肽表達載體，并使其在大腸桿菌中得到表達，獲得人胰島素C肽。 方法 根據(jù)GenBank中C肽序列，合成胰島素C肽cDNA，并將之克隆到融合蛋白表達載體pGEX-4T-1中，構建表達載體pGEX-4T-1+C-peptide，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切并經(jīng)DNA測序證實為所需要的質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染

3、大腸桿菌BL-21，異丙基硫代半乳糖(IPTG)誘導表達含有C肽和凝血酶的融合蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮蘭染色證實有融合蛋白表達后，谷胱甘肽(GST)純化柱和HitrapBenzamidine柱純化，得到C肽溶液，經(jīng)Western-Blot鑒定為所需表達C肽后，經(jīng)濃縮、過濾除菌并配制為工作濃度。 結果 重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定以及基因測序結果與Genbank中C肽cDNA大小及序列一致，誘導表達產(chǎn)物、

4、純化產(chǎn)物的電泳結果分別與C肽凝血酶以及C肽的分子量一致，Western-Blot結果證實所得產(chǎn)物為人胰島素C肽。 結論 利用pGEX-4T-1+C-peptide表達載體誘導表達C肽成功并符合要求。 第二部分 胰島素C肽對鏈脲霉素糖尿病鼠動脈粥樣硬化相關因子的影響 目的 探討人胰島素C肽對1型糖尿病大鼠動脈粥樣硬化相關因子的影響。 方法 STZ50mg/kg體重腹腔注射W

5、istar大鼠建立1型糖尿病鼠動物模型。用藥后一周、兩周、三周尿糖強陽性，注射后兩周空腹血糖濃度大于13.88mmol/L的大鼠確定為實驗性大鼠。隨機分為3組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以30R胰島素1單位皮下注射，B組每日給以30R胰島素1單位加C肽3.6μg皮下注射，C組給以30R胰島素1單位加36μgC肽皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細胞并留取胸腹主動脈血管標本。采用硝酸還原酶法測定血清一氧化氮濃度

6、，化學比色法測定腹主動脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR法檢測主動脈粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、巨噬細胞CD40及CD40LmRNA表達量，以β-actin作為內(nèi)對照。 結果 普通劑量C肽組、大劑量C肽組NO水平及NOS活性高于單用胰島素組，大劑量C肽組與普通劑量組NO水平相比沒有統(tǒng)計學差異。VCAM-1、ICAM-1、CD40和CD40L半定量RT-PCR顯示，大劑量C肽組相對光密度值高于單用胰島素組和

7、普通劑量C肽組，普通劑量C肽組相對光密度值與單用胰島素組相比較，沒有顯著差異。 結論 在1型糖尿病鼠動物模型，普通劑量C肽能增加NO水平和NOS活性，大劑量C肽能增加VCAM-1、ICAM-1、CD40和CD40L的表達。 第三部分 胰島素C肽對2型糖尿病鼠動物模型動脈粥樣硬化相關因子影響 目的 探討人胰島素C肽對2型糖尿病大鼠動脈粥樣硬化相關因子的影響。 方法 2型糖尿

8、病鼠動物模型－LOLETF大鼠隨機分4組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以30R胰島素1單位皮下注射，B組每日給以30R胰島素1單位加C肽3.6μg皮下注射，C組給以30R胰島素1單位加C肽36μg皮下注射，D組給予生理鹽水0.02ml皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細胞并留取胸腹主動脈血管標本。采用硝酸還原酶法測定血清一氧化氮濃度，化學比色法測定腹主動脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR方法檢測粘附分子(I

9、CAM-1、VCAM-1)、CD40及CD40LmRNA表達量，以β-actin作為內(nèi)對照。 結果 血清NO水平和腹主動脈NOS活性測定結果顯示，各組之間相比較均沒有顯著差異。VCAM-1表達顯示，大劑量C肽組與普通劑量C肽組間沒有顯著差異，其余各組之間均有統(tǒng)計學差異。ICAM-1產(chǎn)物表達測定顯示，生理鹽水組和普通劑量C肽組沒有顯著差異，其余各組之間都有顯著性差異。CD40、CD40L結果顯示大劑量C肽組、生理鹽水組和普

10、通劑量C肽組相對光密度值顯著高于單用胰島素組，大劑量C肽組、生理鹽水組和普通劑量C肽組間相比較，沒有顯著差異。 結論 在2型糖尿病大鼠，C肽的濃度增加，可以明顯增加CD40、CD40L以及ICAM、VCAM的表達，而對NO水平和NOS活性影響不大。 第四部分 胰島素C肽對高脂喂養(yǎng)大鼠動脈粥樣硬化相關因子影響 目的 探討人胰島素C肽對正常大鼠動脈粥樣硬化相關因子的影響。 方法

11、 正常Wistar大鼠隨機分3組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以C肽3.6μg皮下注射，B組每日給以C肽36μg皮下注射，C組每日給予生理鹽水0.01ml皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細胞并留取胸腹主動脈血管標本。采用硝酸還原酶法測定血清一氧化氮濃度，化學比色法測定腹主動脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR法檢測粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、CD40及CD40LmRNA表達量，以β-actin

12、作為內(nèi)對照。 結果 大劑量C肽組NO水平顯著高于生理鹽水組和普通劑量C肽組，生理鹽水組和普通劑量C肽組NO水平相比較沒有統(tǒng)計學差異。大劑量C肽組腹主動脈NOS活性顯著高于生理鹽水組，其它各組間沒有統(tǒng)計學差異。VCAM-1和ICAM-1RT-PCR顯示，大劑量C肽組相對光密度值顯著高于普通劑量C肽組和生理鹽水組，普通劑量C肽組和生理鹽水組間沒有顯著差異。CD40、CD40L的表達顯示，大劑量C肽組相對光密度值顯著高于普通劑