1、目的:
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種慢性進展惡化的炎癥性疾病,由多因素致病。COPD的反復急性加重將會導致肺功能進一步減退,加重氣道炎癥并增加病死率。感染和非感染因素都會引起COPD急性加重,其中氣道粘液高分泌和細菌感染是COPD加重的常見原因。近期研究結果顯示吸煙小鼠對銅綠假單胞菌的清除減低,延遲清除伴隨臨床表現(xiàn)惡化和氣道炎癥增加。但該實驗

2、發(fā)現(xiàn)吸煙不影響巨噬細胞的吞噬活性,表明有不依賴于吞噬機制導致的銅綠假單胞菌清除延遲。吸煙也降低支氣管肺泡灌洗液中的SPA。缺乏SPA小鼠較野生型小鼠銅綠假單胞菌感染后具有更多的細菌負荷,同時伴有增加的TNF-α。
　　 COPD宿主固有防御受損,最重要的是粘液纖毛清除功能(Mucociliaryclearance,MCC)功能減低。MCC在COPD發(fā)病中的作用日益引起人們的重視。MCC主要是由纖毛和粘液組成,它是呼吸系統(tǒng)的重要防

3、御機制之一,它主要通過纖毛擺動對粘液的清除,從而把吸附在粘液中的細菌等微生物排出體外。COPD時,MCC異常,導致粘液潴留,氣流受限及細菌感染,可以引起COPD急性加重。但目前缺乏合適的動物模型能同時觀察COPD肺的清除功能及呼吸道MCC功能。
　　 標準桃金娘油是一種從植物中提取的脂溶性揮發(fā)油,其主要成分是桉油素、檸檬烯和α-蒎烯。它能增強黏液纖毛清除功能,并有一定的抗炎作用。國外臨床研究表明標準桃金娘油可以防止COPD患者氣

4、道阻塞,減少急性發(fā)作次數(shù)。但其作用機制尚不清楚。粘液高分泌是氣道阻塞的重要原因,而細菌感染是COPD急性加重的主要誘因。由此,我們設想標準桃金娘油是否通過減少氣道粘液分泌、改善MCC功能來促進下呼吸道細菌的清除,從而減輕氣道阻塞、減少肺內細菌定植。
　　 吸煙被認為是COPD發(fā)病的最主要危險因素。有研究表明吸煙損傷纖毛結構及功能、導致粘液高分泌,影響粘液纖毛清除功能,感染病原體不能被有效清除,從而放大免疫炎癥反應,促進中性粒細胞

5、釋放彈性蛋白酶,氧化劑及金屬蛋白酶等引起組織破壞及增加粘蛋白分泌,促進COPD的發(fā)生和發(fā)展。吸煙可刺激單核巨噬細胞和T細胞等炎癥細胞產生前炎癥因子、趨化因子及細胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等。炎性介質在啟動和維持粘蛋白高分泌中起重要作用。已經證實TNF-α導致氣道粘蛋白表達增加。NF-κB是轉錄調節(jié)因子家族的組成部分,調節(jié)炎癥免疫反應基因的表達。在吸煙導致粘蛋白高分泌中,NF-κB是重要的信號通路。
　　

6、 本實驗我們采用被動吸煙的方法建立COPD大鼠模型來研究吸煙對粘液纖毛傳輸系統(tǒng)的影響;觀察COPD大鼠PA感染后細菌清除和免疫炎癥反應過程;同時給予標準桃金娘油進行干預,觀察標準桃金娘油在下呼吸道細菌清除、氣道炎癥及黏蛋白高分泌中的作用;并進一步探討標準桃金娘油參與氣道細菌清除及粘液高分泌的分子機制,為COPD的防治提供了一個新的視角。
　　 方法:
　　 1、Wistar大鼠隨機分組,采用被動吸煙12周的方法建立COP

7、D大鼠模型。對照組不做任何干預。標準桃金娘油組于每日吸煙前給予標準桃金娘油灌胃治療至第12周末。
　　 2、用HE染色評估肺部病理改變及形態(tài)學測量。
　　 3、小動物肺功能儀測定大鼠肺功能。
　　 4、掃描電鏡觀察大鼠氣道纖毛形態(tài)學。
　　 5、99mTc-SC氣溶膠顯像測定氣道MCC功能。
　　 6、制備大鼠銅綠假單胞菌肺部感染模型。
　　 7、行支氣管肺泡灌洗計數(shù)白細胞及菌落數(shù)。

8、>　　 8、用ELISA法測定肺部TNF-α、IL-6的含量。
　　 9、采用AB-PAS染色方法了解氣道杯狀細胞增生情況。
　　 10、用免疫組化法測定氣道上皮Muc5ac的表達。
　　 11、采用熒光定量RT-PCR方法檢測氣道Muc5ac mRNA的表達。
　　 12、采用Western blot方法檢測肺部信號蛋白NF-κB的表達水平。
　　 結果:
　　 1、吸煙導致COPD大

9、鼠模型。
　　 吸煙12周大鼠出現(xiàn)明顯氣道炎癥和肺氣腫的病理改變:FEV0.3/FVC、PEF顯著降低。
　　 2、掃描電鏡觀察到COPD組大鼠氣道上皮破壞,纖毛細胞數(shù)量顯著減少,有的上皮完全脫落。
　　 3、99mTc-SC氣溶膠顯像測定氣道MCC功能,結果顯示COPD組的氣道粘液纖毛清除率較對照組明顯下降(P＜0.05)。
　　 4、與對照組相比,COPD大鼠銅綠假單胞菌清除減低(P＜0.05),標準

10、桃金娘油組大鼠肺組織勻漿及支氣管肺泡灌洗液中活菌計數(shù)明顯降低(P＜0.05)。
　　 5、COPD大鼠肺內細胞總數(shù)、中性粒細胞以及前炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的表達增加,標準桃金娘油減少吸煙引起的炎癥細胞及炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放。
　　 6、AB-PAS染色結果示COPD組大鼠氣道上皮杯狀細胞明顯增加,標準桃金娘油能抑制吸煙引起的杯狀細胞增生(P＜0.05)。
　　 7、熒光定量RT-PCR和免

11、疫組化檢測結果顯示吸煙從基因和蛋白水平增加粘蛋白Muc5ac表達,標準桃金娘油明顯抑制吸煙引起氣道粘蛋白Muc5ac的表達(P＜0.05)。
　　 8、銅綠假單胞菌感染引起Muc5ac粘蛋白表達增加在24h時達高峰,72h后有所降低。
　　 9、COPD大鼠模型中肺組織NF-κB水平明顯增高,標準桃金娘油抑制吸煙導致的NF-κB表達增加。
　　 10、標準桃金娘油組大鼠肺部細菌計數(shù)減少與粘蛋白Muc5ac、NF-

12、κB的表達下降及炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放減少呈正相關。
　　 結論:
　　 COPD大鼠較對照組大鼠對銅綠假單胞菌的清除能力明顯減低,這種清除缺陷同時伴有氣道上皮MCC減低。COPD大鼠細菌定植放大和延長免疫炎癥反應,同時促進粘蛋白表達。標準桃金娘油促進銅綠假單胞菌從肺內清除。它能抑制吸煙導致的粘蛋白Muc5ac高分泌;同時亦能抑制由吸煙引起的炎癥因子釋放及NF-κB表達。標準桃金娘油增加細菌清除與它能抑制氣道