1、目的：使受損脊髓功能得到恢復依然是再生醫(yī)學的難題。細胞移植被普遍認為是最有希望治療脊髓損傷的策略之一，但其前景取決于移植物與脊髓斷端融合，并有足夠的軸突再生并跨過脊髓建立有效地連接。為此，利用組織工程支架材料、種子細胞等工程學技術重建脊髓的方法，是近年來研究的熱點<'[1]>。 我們先前的研究業(yè)已表明應用化學萃取的家犬脊髓神經基膜樣組織具有三維網狀結構，可為人臍帶間充質干細胞分化、增殖提供良好載體。最近，我們利用這種質地柔軟的脊

2、髓神經基膜樣組織作為髓芯，外面包被用天然生物膜材料(國食藥監(jiān)械準字2006第3460627)做成的帶有腦脊液通道的螺旋凸梁式圓管，制成脊髓生物支架。本實驗目的是對這種新型脊髓支架與人臍帶間充質干細胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUCMSCs)的生物相容性進行了研究，為橫貫性脊髓損傷動物模型及臨床應用奠定基礎。 方法：1、脊髓生物支架內髓芯的制備：切取幼犬胸段脊髓長約5

3、cm，浸入40ml/L TritonX-100的蒸餾水溶液在4℃冰箱中過夜；蒸餾水浸浴3h后放入40mM/L脫氧膽酸鈉蒸餾水溶液中，置4℃冰箱12h。以上步驟重復4次。萃取后的髓芯分為三部分：大部分經無菌試驗處理后置4℃冰箱待用，部分行電鏡及冰凍切片觀察，剩余部分通過真空冷凍干燥處理后保存。 2、人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)：取足月妊娠剖宮產健康胎兒的臍帶，以PBS充分沖洗，剔除臍帶動、靜脈，將其余的臍帶間質組織切割成直徑約1mm大

4、小的組織塊，在含有20％的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100U/ml青霉素，10μg/ml鏈霉素的高糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)5-7天后，顯微鏡下可見大量細胞自組織塊中游出，向外呈放射狀貼壁生長。待10天左右，細胞達到80％-90％匯合后，加入0.2％胰酶消化傳代。收集第三代MSCs經流式細胞學檢測細胞表面抗原證實其為臍帶間充質干細胞后凍存待用。 3、將用天然生物膜材料做成的帶有腦脊液通道的螺旋

5、凸梁式圓管部分切開，作斷面及內表面掃描電鏡觀察，剩余部分圓管套在已制備好的髓芯的上，置4℃冰箱待用。 4、凍存的人臍帶MSCs復蘇后與脊髓生物神經支架相容性研究：對凍存的人臍帶MSCs復蘇使細胞密度達到1×10<'6>/ml，分點注入支架內，置入干細胞一支架體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為48、72、96小時，應用冰凍切片及Hitachi掃描、透射電鏡觀察人臍帶MSCs在不同時間點的生長發(fā)育情況。 結果：1、經組織塊原代

6、培養(yǎng)約5天后，可見大量細胞自組織塊游出，于周邊向外貼壁呈放射狀生長，形態(tài)較均一，呈長梭形。10天達到80％-90％匯合，鏡下可見細胞胞漿豐富，軸突伸長，多角狀。消化后以1:2-1:3的比例傳代細胞，接種約30分鐘后細胞迅速貼壁，經換液完全匯合時鏡下可見細胞排列緊密，無序生長，經傳代培養(yǎng)3代后細胞形態(tài)未見明顯變化，經流式細胞學檢測MSCs的標志抗原CD29、CD44、CD105均為陽性，HLA-D陰性，符合間充質干細胞特性。 2

7、、化學萃取后的脊髓依然呈長扁圓形，但直徑有所增粗，后正中裂距離加寬，乳白色、質軟。HE染色可見經化學方法萃取的脊髓橫切片中無任何細胞，質地較致密，內可見蜂窩狀網格。掃描及透射電鏡可見去細胞髓芯的髓鞘、細胞等結構均消失，整個視野由板層樣結構組成，神經纖維間基質和基底膜形成圓形較規(guī)則、均一的腔隙。特別是掃描電鏡支架中存在神經元被化學萃取后殘留的“空穴”，其大小與神經元直徑(1.5-15um)相一致。真空冷凍干燥保存的髓芯肉眼下仍呈長扁圓形，

8、但直徑變小，硬度有所增加，斷面可見組織塊更加致密。 3、天然生物膜材料肉眼下為帶有腦脊液通道的螺旋凸梁式圓管狀。生物膜圓管切開后，掃描電鏡觀察斷面及內表面。斷面可見該生物膜圓管呈分層狀，由數(shù)層膜壓制而成，而且部分膜之間夾有數(shù)層較厚的材料。內表面在電鏡下觀察可見膠原樣結構呈蜂窩狀。 4、人臍帶MSCs接種于包被生物膜圓管的脊髓生物支架內行體外條件養(yǎng)后，取48、72、96小時三個時間段，分別行冰凍切片HE染色、掃描電鏡觀察

9、。冰凍切片HE染色見萃取的脊髓生物支架中有細胞在蜂窩樣結構內生長，細胞呈點狀、星芒狀散居于間質之間，沿間質生長，并有突起伸長，經過一段時間部分細胞呈多角形。掃描電鏡觀察可見細胞黏附于網格樣結構上，出現(xiàn)明顯的神經球，細胞生長狀態(tài)良好，其表面微絨毛結構清晰可見。神經球體積變大，生成多個突起，形成突觸樣結構。 結論：凍存的人臍帶MSCs復蘇后注入自行研制的脊髓生物支架內進行體外培養(yǎng)，可見注入的人臍帶MSCs在膠原纖維骨架上貼伏并生長良