1、背景:骨質缺損的臨床治療長期以來一直是骨科領域中尚待解決的難題之一.其根本原因是尚未找到一種理想的骨組織替代物,理想的材料應當是:1、與人體組織相容性好,無免疫源反應;2、與人骨力學性能相似,具有一定的強度和支撐力;3、應有良好的誘導成骨活性;4、取材方便,易于大量制作;5、能被宿主骨組織吸收替代.在骨組織工程研究中,現行的材料都不十分理想,傳統的植入材料,例如:金屬、陶瓷、高分子植入物在人體內永遠是異物,在生物相容性、生物活性、生物可

2、降解性及與宿主骨的力學匹配性等方面都有各自的缺點,自體骨移植效果雖好,但來源有限,尤其是對于兒童和老人.因此,全世界都在尋找一種易塑形、生物相容性好、有足夠強度的骨缺損修復材料.骨組織工程的三個關鍵要素是信號分子(骨生長因子、骨誘導因子)、特定組織的細胞和細胞載體材料.其中研制理想的細胞載體材料是組織工程的關鍵.一方面,它必須滿足各種生物相容性、生物可降解性及力學性能要求;另一方面,它還必須易于制成各種理想的形狀以適于細胞與載體的復合,

3、實現細胞在三維空間的生長、組織再生.這也是目前骨組織工程的難點.細胞載體材料分為可吸收材料與不可吸收材料兩大類,從目前的使用情況看,可吸收材料比不可吸收材料好.可吸收材料(多孔結構)包括以下幾類:(1)合成和天然礦物:活性生物陶瓷、脫有機物的骨礦、磷酸三鈣.(2)天然高分子:各類膠原;(3)合成高分子:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸.活性生物陶瓷一般具有促使人體硬組織的再生和修復的作用,其中磷酸鈣鹽生物陶瓷材料對宿主組織具有良好的生物相容性

4、,對人體無毒,無刺激,無過敏,不致癌,在人體內不產生免疫排斥反應.因此生物陶瓷材料是目前較為理想的組織支架材料.但是人體不同組織長入需要不同的孔徑.結締組織長入,微孔徑應為50 μ m,而骨組織長入需100μ m,低于100μ m時骨長入受限,孔徑大于250 μ m時才有完整骨單位長入.此外對生物陶瓷要求不僅有適宜的孔徑大小,而且為了要增加骨融合速度,很重要的一點是孔隙率要高,以天然珊瑚制成的人工骨為例,孔隙直徑200 μ m,孔隙率僅

5、僅53﹪.當這種人工骨與宿主骨結合后,形成類似"磚石混凝土結構",較大體積的人工骨長期得不到降解,明顯形成體內異物,嚴重影響骨融合速度.目的:研制一種具有骨誘導能力和一定強度,適于成骨細胞爬行替代的可降解高孔隙率支架作為細胞載體材料.我們通過與天津大學材料學院、中科院固體材料研究所合作,研制出一種孔隙率高,抗壓強度大的磷酸鈣成骨細胞爬行支架生物陶瓷.將納米氧化鋯顆粒和羥基磷灰石復合制作的.方法:分為以下方面進行研究一、支架的制備實施方法

6、:1:羥基磷灰石制備本發(fā)明以醫(yī)用級碳酸鈣(CaCO<,3>)和二水磷酸氫鈣(CaHPO<,4>·2H<,2>O)為原料,按一定Ca/P摩爾比,將所稱料倒入球磨罐中,加入去離子水和氧化鋯磨球.將混合料高速球磨24小時,再將混合料移入水熱反應釜中,反應溫度為120℃,壓力為3MPa,反應40分鐘之后將混合料取出,在烘箱中于85℃恒溫干燥,干燥后在800℃煅燒,獲得長徑比約為10的針狀羥基磷灰石粉末.2:納米氧化鋯顆粒制備本發(fā)明采用按氧化鋯和

7、氧化釔的摩爾比為97:3溶入40℃去離子水中,以此作為基液;將濃度為3N的氨水同時滴入基液中,并不斷攪拌,在整個反應過程溶液的溫度保持在40~45℃之間,pH值在9~10之間,待沉淀完全生成后再繼續(xù)攪拌1/2小時;將沉淀過濾、水洗3遍,再醇洗2遍,完全去除Cl-離子;把離心過濾后的沉淀物在烘箱中干燥,溫度不超過80℃,干燥后粉末過80目篩,于800℃煅燒1小時,冷卻后過200目篩,制得的ZrO<,2>(Y<,2>O<,3>)復合粉末粒徑

8、在20~50nm之間.氧化鋯粉末的粒徑為20~50nm.3:納米氧化鋯增強β-磷酸鈣(β-磷酸鈣/氧化鋯)高孔隙率成骨細胞爬行支架的制備稱取一定比例納米氧化鋯顆粒和羥基磷灰石粉末,并加入含SiO<,2>和Na<,2>O的復合添加劑成復合粉末.將復合粉末加入去離子水中,在微粒球磨機上混磨4小時,磨球為氧化鋯球;混磨后的料漿倒入盛料槽中,選用孔隙率92﹪,孔徑300um的聚氨酯海綿并用NaOH堿液處理,然后浸入料漿中,而后將浸有料漿的海綿取

9、出,通過碾輪將海綿中的多余料漿碾出;被料漿包裹的海綿成型體在室溫干燥12小時之后,再在烘箱中干燥;干燥試樣在燒結爐中燒結.結果:經過天津大學材料學研測試:氣孔率為75﹪~93﹪,孔徑大小在200~450μm之間,孔分布均勻、貫通,抗壓強度2.0MPa.二、支架的生物學評價實施方法:1.細胞毒性實驗:本實驗采用納米支架材料的浸提液,按下面兩種方法進行實驗:1)細胞形態(tài)觀察法:用待測材料及陰、陽性參照材料的標準濃度浸提液在Φ35mm培養(yǎng)皿內

10、,按細胞密度為6×10<'4>/ml培養(yǎng)Hos8603成骨細胞,通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況.2)MTT法:細胞相對增值率(RGR)=(實驗組A均值/陰性對照組A均值)×100﹪,再根據計算值進行細胞毒性分級.2.全身急性毒性試驗:該實驗采用支架材料的浸提液小鼠尾經脈注射,陰性對照為同批號生理鹽水,陽性對照為6.4﹪苯酚溶液,注射后24h、48h、72h稱量體重變化,觀察一般狀態(tài)、毒性表現及死亡情況.3.溶血試驗:該實驗采用支架

11、材料的浸提液作體外實驗,測定兔紅細胞溶解和血紅蛋白游離程度,對其體外溶血性進行評價.結果:1.支架材料細胞毒性為0~1級.2.支架材料組小鼠的全身一般狀況良好,未見明顯毒性表現,體重均出現增長現象,72h觀察期內活動如常,飲食飲水均正常,無動物死亡現象.3.支架材料的溶血率為2.064﹪,體外實驗不引起溶血反應.三、Hos8603細胞與支架聯合培養(yǎng)實驗實施方法:1.用成骨細胞株Hos8603與納米支架浸提培養(yǎng)液和對照培養(yǎng)液培養(yǎng),分別倒置

12、顯微鏡觀察細胞生長、增殖情況,并統計細胞成活率,了解支架材料對細胞生長的影響,并繪制出細胞生長曲線.2.用成骨細胞株Hos8603與支架復合進行培養(yǎng),電鏡觀察細胞與支架材料黏附情況,判斷支架材料對細胞黏附性能.結果:實驗中觀察到納米骨支架浸提液培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細胞株Hos8603其生長曲線與陰性對照體外培養(yǎng)成骨細胞無顯著差異,兩條生長曲線基本重疊.培養(yǎng)第一天增加不明顯,在第二天到第四天曲線有明顯上升趨勢,數值變化較大,第五天增長趨勢趨緩,

13、第六天曲線開始下降.兩組細胞均表現出了相同的趨勢和規(guī)律.四、原代兔成骨細胞培養(yǎng)實施方法:1.骨髓間充質干細胞誘導分化粗穿刺針頭插入兔股骨髓腔,快速負壓抽吸骨髓液,移入已裝有2ml 100u/ml肝素鈉抗凝液離心管中,抗凝與37℃預熱DMEM培養(yǎng)液混勻.骨髓抗凝液中加入紅細胞裂解液8ml,靜置10min,1500g離心8分鐘,將沉淀的大單核細胞混懸,移入50ml培養(yǎng)瓶37℃、5﹪CO<,2>及飽和濕度條件下培養(yǎng),每天觀察,第4天換液.骨髓

14、間充質干細胞培養(yǎng)7天,換用含誘導作用的培養(yǎng)液(10mmol/L β-甘油磷酸鈉,10nmol/L地塞米松,50mg/ml抗壞血酸)繼續(xù)培養(yǎng),隔天換液,使間充質干細胞向成骨細胞分化,長滿瓶底80﹪-90﹪,用0.5﹪胰蛋白酶消化,以1傳2常規(guī)傳代培養(yǎng).鏡下觀察成骨細胞形態(tài).2.成骨細胞的鑒定2.1堿性磷酸酶染色細胞爬片經固定后行改良鈣鉆法進行堿性磷酸酶染色,可見細胞質與細胞膜上有粗大的深褐色顆粒存在,有些甚至成片而遮蔽細胞核.2.2堿性磷

15、酸酶活性定量測定(測定盒購自南京建成生物工程研究所)堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉,產生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據紅色深淺可以測定酶活力的高低.2.3成骨細胞蛋白質定量測定蛋白質分子具有-NH<,3>基團,當棕紅色的CBBG250染料上的陰離子與蛋白-NH3結合,使溶液變成為藍色,通過測吸光度可以計算出蛋白含量結果:兔骨髓間充質干細胞經誘導培養(yǎng)后形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮?長多邊形,有明顯突起

16、,少數細胞呈星形.在傳代培養(yǎng)后期,出現細胞呈鱗片樣聚集生長趨勢,胞漿淺,但可見有顆粒樣物質出現,并由少變多,細胞核變大,有1-2個核仁,可見處于核分裂相細胞.表現出成骨細胞形態(tài)改變.經堿性磷酸酶染色鑒定為表形活躍的成骨細胞,染色結果判定為3+.檢測堿性磷酸酶活性為10.72金氏單位/萬細胞或45.8金氏單位/毫克.五、原代兔成骨細胞與納米骨支架聯合培養(yǎng)實施方法:用3代兔成骨細胞與支架復合進行培養(yǎng).并利用改進的MTT法進行三維支架中兔成骨