1、各種原因造成的臨床大段骨缺損以及骨不連的修復(fù)問題,都是骨科學(xué)術(shù)界一直以來研究的熱點以及難點。目前臨床上通常采用的處理辦法包括自體骨移植和異體骨移植,然而其相關(guān)技術(shù)均不同程度地存在一些不足,故而無法達到臨床的實際應(yīng)用需求。隨著骨組織工程領(lǐng)域不斷深入的研究,其為臨床骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法。組織工程骨材料復(fù)合種子細胞以及神經(jīng)因子應(yīng)用于大段骨缺損修復(fù),具有良好的可塑性以及成骨效應(yīng),臨床應(yīng)用備受期待。
　　骨折愈合是一個復(fù)雜的生理

2、過程,涉及多種細胞和細胞因子之間的協(xié)同作用。生長因子作為人體組織和器官發(fā)生、發(fā)育以及成熟的重要物質(zhì),為骨缺損修復(fù)提供最基本的營養(yǎng)基礎(chǔ),而神經(jīng)遞質(zhì)對骨代謝的影響作用尤為突出。P物質(zhì)(substance P,SP)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽遞質(zhì),已經(jīng)證實SP神經(jīng)肽來源于感覺神經(jīng)纖維,可作用于成骨細胞,且貫穿于骨折愈合的整個過程。然而目前的實驗研究存在分歧,SP對骨代謝成骨細胞的作用效果尚不明確。據(jù)文獻報道證實,成骨細胞與血管內(nèi)皮細胞體外聯(lián)合共培養(yǎng)體

3、系,可促進成骨細胞的增殖以及組織工程骨的血管化再生進程,有助于增強組織工程骨對骨缺損的修復(fù)。因此,本實驗通過建立骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)源性內(nèi)皮細胞(ECs)與成骨細胞(OB)體外聯(lián)合培養(yǎng)體系,觀察SP對此共培養(yǎng)細胞體系的最適濃度以及作用效果,明確SP對內(nèi)皮與成骨細胞共培養(yǎng)體系功能的影響,探索SP在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用前景。
　　目的:
　　觀察P物質(zhì)(substance P,SP)在骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)源性內(nèi)皮細

4、胞(ECs)與成骨細胞(OB)體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度;以及其對BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細胞體外聯(lián)合培養(yǎng)的作用,為應(yīng)用SP促進組織工程骨修復(fù)骨缺損提供實驗支持。
　　方法:
　　第一部分:P物質(zhì)在BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度
　　采用新生新西蘭大白兔胎兔(雌雄不限)密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)干細胞行體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代,獲得較純的BMSCs。連續(xù)傳代后第3代BMSCs進行分化誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞以

5、及成骨細胞,并進行細胞相關(guān)定性檢測鑒定。兩種細胞誘導(dǎo)7d后,將其按照1:2比例直接混合培養(yǎng),待細胞傳至第2代后,加入1×10-12-1×10-6 mol/L不同濃度的SP作為實驗組,以正常未加SP的細胞培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)后1、3、5、7d采用CCK-8法測定細胞增殖活性,并用sigma-plot軟件生成生長曲線,觀察細胞生長數(shù)量,測定堿性磷酸酶活性及骨鈣素表達量。
　　第二部分:P物質(zhì)對BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體

6、系的作用效果觀察
　　分別建立BMSCs源性內(nèi)皮細胞(ECs)與成骨細胞(OB)單獨培養(yǎng),或按1:2的比例體外直接或間接共培養(yǎng)體系,細胞內(nèi)同時加入1×10-8 mol/L SP。培養(yǎng)48小時后采用流式細胞周期分析細胞增殖與活性,并分別采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測堿性磷酸酶(ALP)的表達,實時定量PCR(rt-PCR)檢測骨鈣素(OC)mRNA基因的表達。以不添加SP的細胞培養(yǎng)體系作為對照組,比較加入SP時各組細胞功能的變化。

7、
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　CCK-8曲線圖可以直觀的看出1d時除低濃度組1×10-12mol/L作用效果不明顯外,其余SP濃度組作用效果明顯;3d以后SP各濃度組對共培養(yǎng)細胞均具有促進作用且隨著時間的推移作用效果呈現(xiàn)增長,而SP濃度組1×10-8mol/L時細胞的促進增殖效果最明顯,組間比較效果顯著,細胞增生活躍。堿性磷酸酶ALP活性表達結(jié)果提示3d以后SP作用效果明顯,低濃度組1×10-12 mol/L作用效

8、果不明顯,而1×10-8-1×10-6mol/L作用效果明顯。骨鈣素(BGP)的表達檢測中3d以后各濃度SP實驗組較空白對照均有所提高,而在1×10-8 mol/L的SP濃度組作用效果最明顯,且在1×10-8 mol/L濃度組相較于其他SP實驗組也具有顯著性差異。
　　第二部分:
　　較OB單獨培養(yǎng),間接共培養(yǎng)時流式細胞周期檢測表現(xiàn)為G1期明顯減少,S期阻滯(P<0.05);ALP的表達有所提高(P<0.05);OC mRN

9、A的表達則顯著性升高(P<0.001)。較OB單獨培養(yǎng),直接共培養(yǎng)時ALP和OC mRNA的表達均顯著性升高(P<0.001)。在促進ALP和OC mRNA的表達上,直接共培養(yǎng)較間接共培養(yǎng)均有所提高(P<0.05)。加入SP后,實驗組OB單獨培養(yǎng)相較對照組OB單獨培養(yǎng),流式細胞周期檢測顯示細胞阻滯于G2/M期,G1期明顯減少(P<0.05);ALP活性有所升高,OC的mRNA的表達水平也有所提高(P<0.05)。實驗組共培養(yǎng)細胞較對照組

10、共培養(yǎng)細胞,流式細胞周期檢測顯示G1期明顯減少(P<0.001),細胞阻滯于G2/M及S期;ALP的表達有所上升,OC的mRNA的表達水平有所提高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　在體外內(nèi)皮與成骨細胞聯(lián)合共培養(yǎng)中,SP對新種子細胞促進效果明顯,其在1×10-8mol/L對聯(lián)合共培養(yǎng)的成骨細胞增殖和活性作用最強。BMSCs源性內(nèi)皮細胞與成骨細胞共培養(yǎng)體系細胞相容性良好,SP可促進OB的活性,并且可顯著促進共培養(yǎng)體系中OB的增