1、卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，卵巢惡性上皮性腫瘤死亡率居首，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。Ras是腫瘤中最常見(jiàn)的癌基因，70％以上的卵巢癌中可檢測(cè)到Ras蛋白過(guò)度表達(dá)。Ras可以激活許多下游信號(hào)通路，其中包括Aurora kinases家族和Stanniocalcin家族。
　　第一部分 Ras相關(guān)Aurora kinases和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)腫瘤發(fā)生的機(jī)理研究
　　背景：極光激酶（Aurora kinases）是一個(gè)絲/蘇氨

2、酸蛋白激酶家族，位于Ras信號(hào)通路下游，與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)，且在多種腫瘤中有高表達(dá)，是一種重要的癌基因。卵巢癌和胰腺癌中常同時(shí)存在極光激酶A/B(Aurora kinase A/B，AurA/B)的激活或乳腺癌易感蛋白1/2（Breast cancer susceptibility protein1/2，BRCA1/2）的失活。AurA/B和BRCA1/2之間的不平衡可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生，但是，這些分子之間的相互作用和調(diào)控

3、腫瘤發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。
　　目的：研究AurA/B和BRCA1/2之間的相互調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤發(fā)生的影響，為優(yōu)化AurA/B和BRCA1/2相關(guān)腫瘤的診斷和治療提供指導(dǎo)。
　　方法：卵巢癌細(xì)胞株OVCA433和在胰腺癌細(xì)胞株Capan-1中，用特定shRNA單獨(dú)或聯(lián)合沉默AurA/B或/和BRCA1/2，檢測(cè)所獲細(xì)胞株中AurA/B和BRCA1/2蛋白和mRNA的水平，并研究這些細(xì)胞的增殖能力、平板克隆形成能力、細(xì)胞周期分布及相關(guān)

4、蛋白的表達(dá)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞多核性、染色體四倍體性和裸鼠成瘤能力。
　　結(jié)果：在卵巢癌細(xì)胞系OVCA433中，AurA沉默增加BRCA1/2的表達(dá)，但對(duì)AurB的表達(dá)影響不明顯;干擾AurB的表達(dá)促進(jìn)AurA和BRCA1/2的表達(dá)，同時(shí)沉默BRCA1/2明顯提高AurA的表達(dá)而不影響AurB。在BRCA2基因功能缺陷的胰腺癌細(xì)胞株Capan-1中，AurA和AurB的蛋白表達(dá)相互補(bǔ)充，AurA和AurB沉默后BRCA1的表達(dá)上調(diào)，B

5、RCA1沉默后AurA降低，AurB變化不明顯。在這兩株細(xì)胞中，同時(shí)沉默AurA和AurB明顯提高BRCA1/2的表達(dá)。單獨(dú)或聯(lián)合干擾AurA/B和/或BRCA1/2對(duì)其他基因的mRNA水平?jīng)]有影響。用MG132處理細(xì)胞后，AurA/B和BRCA1/2蛋白之間的相互影響消失。
　　干擾AurA和/或AurB的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、減少平板克隆形成數(shù)、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，而干擾BRCA1和/或BRCA2促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加平板克隆形成數(shù)、促

6、進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)干擾AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2對(duì)細(xì)胞增殖、平板克隆形成能力和細(xì)胞周期的影響。
　　沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白變化，其中比較一致的是p53和cyclinA。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表達(dá)、減少cyclin A的表達(dá)，而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclinA水平，同時(shí)沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/

7、B或BRCA1/2對(duì)p53和cyclin A的影響。
　　相比于對(duì)照組，低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系細(xì)胞多核性和染色體四倍體性降低，而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2細(xì)胞多核性和染色體四倍體性提高，AurA/B和BRCA1/2同時(shí)低表達(dá)的細(xì)胞系中細(xì)胞多核性和染色體四倍體性與對(duì)照組細(xì)胞相當(dāng)。在有絲分裂末期，兩種細(xì)胞中AurA/B和BRCA1/2均同時(shí)定位于中間體，但Capan-1細(xì)胞中BRCA1在中間體的累積不明顯。沉默Au

8、rA和/或AurB增加BRCA2在中間體上的表達(dá)，對(duì)BRCA1影響不明顯，沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中間體的累積。
　　在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，相比于對(duì)照組，低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)慢，而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2的細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)快，同時(shí)低表達(dá)AurA/B和BRCA1/2的細(xì)胞系腫瘤生長(zhǎng)快于AurA和/或AurB干擾組，而慢于BRCA1和/或BRCA2干擾組。
　　結(jié)論：AurA/B

9、和BRCA1/2之間相互負(fù)性調(diào)節(jié)，并反相影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞多核性、四倍體性和腫瘤的發(fā)生。
　　第二部分 Ras下游Stanniocalcin2在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)理
　　背景：分泌型蛋白斯鈣素(Stanniocalc in，STC)在魚(yú)類中參與調(diào)節(jié)鈣磷平衡。人類STC包含STC1和STC2兩個(gè)成員，均和多種腫瘤有關(guān)。RAS轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞中STC1水平升高，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，但STC2在卵

10、巢癌中的作用還不清楚。
　　目的：研究STC2在卵巢癌發(fā)生中的作用及機(jī)制，為卵巢癌的診斷及治療提供思路。
　　方法：首先在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中轉(zhuǎn)染HA-tag標(biāo)記的STC2 cDNA，以證明分泌型蛋白STC2可以作用于自身細(xì)胞;然后在一系列卵巢癌細(xì)胞系中用STC2shRNA或cDNA沉默或過(guò)表達(dá)STC2，以系統(tǒng)研究STC2對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、平板克隆、周期進(jìn)程、對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性及細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;并構(gòu)建動(dòng)物模

11、型，以觀察STC2在體內(nèi)的作用;最后構(gòu)建人高級(jí)別漿液性卵巢癌和正常卵巢的組織芯片，分析STC2與患者生存期的關(guān)系。
　　結(jié)果：STC2可以分泌至細(xì)胞外，再?gòu)陌饨Y(jié)合到細(xì)胞膜上。在Hey、 Hey A8、OVCA420、OVCA429細(xì)胞中，干擾STC2的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和平板克隆形成、促進(jìn)G1-S周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲;相反，在A2780、SKOV3、SKOV3 ip1細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)STC2促

12、進(jìn)細(xì)胞增殖和平板克隆形成、促進(jìn)G1-S周期過(guò)渡、抑制順鉑和紫杉醇引起的凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲。低表達(dá)STC2的細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、CDK6表達(dá)較對(duì)照組低，而促凋亡蛋白Bax、Bid和cytoC表達(dá)較高;抑存活并促轉(zhuǎn)移蛋白p38、pp38表達(dá)升高，STAT3表達(dá)升高或不變，pSTAT表達(dá)下調(diào);MEK、ERK1、pERK1/2蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化;過(guò)表達(dá)STC2的細(xì)胞中以上蛋白變化趨勢(shì)相反。在裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中，

13、干擾Hey細(xì)胞中的STC2抑制腫瘤生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)SKOV3 ip1細(xì)胞中的STC2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);在裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移模型中，低表達(dá)STC2促進(jìn)腹腔種植轉(zhuǎn)移，而過(guò)表達(dá)STC2抑制腹腔轉(zhuǎn)移灶的形成。STC2在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在正常卵巢組織中幾乎不表達(dá)。高表達(dá)STC2的患者有更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。
　　結(jié)論：STC2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和耐藥并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但抑制細(xì)胞遷移侵襲并抑制腹腔種植轉(zhuǎn)移，STC2高表達(dá)可能和卵巢癌患者較好