1、第一部分:ABRA在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及定位
　　目的:觀察肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白ABRA(actin-binding rho-activatingprotein)在成年大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)、基底節(jié)區(qū)、小腦、脊髓的表達(dá)。探討這種新發(fā)現(xiàn)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的可能作用及意義。
　　方法:制備成年大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)、基底節(jié)區(qū)、小腦、脊髓的冰凍切片，采用共聚焦免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ABRA在大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)、基底

2、節(jié)區(qū)、小腦、脊髓的表達(dá)定位。分別采用RT-PCR、western blot檢測(cè)海馬中ABRA mRNA及ABRA蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1) ABRA表達(dá)在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的胞核、胞漿和突起，其中胞核著色最強(qiáng);(2)在大腦皮質(zhì)，ABRA陽(yáng)性神經(jīng)元胞體和突起廣泛分布于皮質(zhì)的分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層、多形細(xì)胞層;(3)在海馬區(qū)，ABRA均勻分布于海馬各部，陽(yáng)性神經(jīng)元集中于錐體細(xì)胞層，而其陽(yáng)性突

3、起彌散分布于海馬分子層和多形層;(4)在基底節(jié)區(qū)，ABRA陽(yáng)性產(chǎn)物廣泛表達(dá)于神經(jīng)元胞體和突起;(5)在小腦，ABRA陽(yáng)性神經(jīng)元胞體分布于浦肯野細(xì)胞層及顆粒層，其陽(yáng)性突起分布于分子層;(6)在脊髓，ABRA陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)在整個(gè)灰質(zhì)和白質(zhì);(7) ABRA與F-actin免疫熒光共定位研究顯示ABRA與F-actin在神經(jīng)元的胞漿和突起共定位。但在海馬區(qū)，ABRA與F-actin僅在神經(jīng)元的突起共定位，在神經(jīng)元胞體沒(méi)有共定位。(8) RT-P

4、CR與western blot檢測(cè)到海馬中分別有ABRAmRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了ABRA在大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)、基底節(jié)區(qū)、小腦、脊髓有廣泛表達(dá)，提示ABRA可能在大鼠這些部位的神經(jīng)細(xì)胞功能活動(dòng)方面起重要作用。
　　第二部分:ABRA在不同年齡階段大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓中的表達(dá)變化
　　目的:檢測(cè)ABRA在不同年齡階段大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓中的表達(dá)變化，從而探討ABRA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

5、過(guò)程中的可能作用及意義。
　　方法:不同年齡階段正常SD大鼠36只，雄雌各半，新生鼠（生后7天，n=12）、成年鼠（6月齡，n=12）、老年鼠（20月齡，n=12）。采用western blot定量檢測(cè)不同年齡階段大鼠大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓中ABRA蛋白水平表達(dá)變化以及采用免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)上述部位ABRA細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:(1)不同年齡階段大鼠大腦皮質(zhì)和海馬中均檢測(cè)到ABRA的表達(dá)，在新生期，ABRA蛋白水平表達(dá)較

6、高，主要表達(dá)在胞漿和胞核;成年期，ABRA蛋白水平較新生期下降，除在胞漿與胞核內(nèi)表達(dá)外，在細(xì)胞的突起也有強(qiáng)表達(dá);在老年期，ABRA蛋白及表達(dá)ABRA的細(xì)胞均顯著下降。(2)不同年齡階段大鼠脊髓中均檢測(cè)到ABRA的表達(dá)。Western blot顯示ABRA在新生鼠脊髓中表達(dá)顯著高于成年鼠及老年鼠。免疫熒光染色顯示ABRA廣泛表達(dá)于神經(jīng)元的胞核、胞漿和突起，在脊髓前角，與前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存在共定位，在脊髓后角，與小的NeuN陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)元存在

7、共定位。同時(shí)，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，在新生鼠，脊髓前角、后角的ABRA與NeuN雙陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)占總ABRA陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著低于成年鼠及老年鼠。
　　結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ABRA在不同年齡階段大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)變化。ABRA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)及隨發(fā)育時(shí)段而變化的事實(shí)提示ABRA可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟、突觸的形成以及可塑性調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　第三部分:shRNA干擾ABRA對(duì)大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響

8、>　　目的:檢測(cè)ABRA在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的表達(dá)定位，并采用構(gòu)建好的RNAi質(zhì)粒載體通過(guò)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元，檢測(cè)針對(duì)ABRA不同靶位點(diǎn)的RNAi對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞ABRA基因表達(dá)的影響，篩選出具有最佳抑制效應(yīng)的shRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，抑制ABRA基因表達(dá)，研究分析ABRA在神經(jīng)元突起生長(zhǎng)與細(xì)胞骨架改變過(guò)程中所起的作用。
　　方法:分離、培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，觀察其生長(zhǎng)和形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用MAP-2熒

9、光標(biāo)記鑒定神經(jīng)元的純度。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)ABRA在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)分布。采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，通過(guò)RT-PCR、western blot、免疫熒光篩選干擾ABRA mRNA表達(dá)的shRNA，選擇抑制作用最明顯的5'端標(biāo)記GFP綠色熒光基團(tuán)的shRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)部位及神經(jīng)元突起生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元純度達(dá)90

10、％。(2) ABRA主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞的胞體、樹突和軸突中，胞體內(nèi)尤為豐富，與MAP-2共定位在樹突中。(3)各組神經(jīng)元轉(zhuǎn)染率分別為23.2％(shNC)、22.4％(shABRA-57)、29.3％(shABRA-371)、22.8％(shABRA-944)、24.6％(shABRA-1015)和23.5％(shGAPDH)，各組間無(wú)明顯差異，其中shNC轉(zhuǎn)染組、shGAPDH轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元ABRA mRNA和蛋白表達(dá)較強(qiáng)，shABRA

11、-57轉(zhuǎn)染組、shABRA-371轉(zhuǎn)染組、shABRA-944轉(zhuǎn)染組和shABRA-1015轉(zhuǎn)染組ABRA mRNA和蛋白表達(dá)均顯著弱于shNC轉(zhuǎn)染組與shGAPDH轉(zhuǎn)染組，以shABRA-371轉(zhuǎn)染組最明顯。(4)shABRA-371轉(zhuǎn)染原代海馬神經(jīng)元，沉默ABRA基因后，表達(dá)ABRA-shRNA的神經(jīng)元突起生長(zhǎng)呈抑制趨勢(shì)，突起坍塌和回縮，胞體已開始變形，軸突的長(zhǎng)度和突起的總長(zhǎng)度及分支點(diǎn)的數(shù)目與對(duì)照組相比顯著減少。
　　結(jié)論:(