1、研究背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,近十年來,結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和導(dǎo)致患者死亡的主要因為,也是結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的直接因為。
　　 促肝細胞再生磷酸酶-3(phosphataseofregeneratingliver-3,PRL-3),屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族成員,現(xiàn)被認為是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的少數(shù)特異性表達分子之一。CDH22(又稱為PB-cadherin)與

2、E-鈣粘附蛋白同屬于鈣粘附蛋白家族經(jīng)典型亞類成員。目前研究發(fā)現(xiàn),鈣粘附蛋白家族中有許多成員都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)β-catenin及其通路相關(guān)基因的改變在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。
　　 在β-catenin通路相關(guān)基因中,處于上游的E-cadherin及處于核心地位的β-catenin正常表達定位于上皮細胞膜,結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸腺瘤惡變和結(jié)直腸癌組織E-cadherin、β-c

3、atenin胞膜表達不同程度缺失,β-catenin呈胞漿(胞核)異位表達。下游通路中的靶基因cyclinD1是調(diào)節(jié)細胞進入細胞周期中增殖期的主要因子,其過度表達和異常調(diào)控均可導(dǎo)致細胞周期發(fā)生異常,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常結(jié)直腸黏膜cyclinD1表達均為陰性,結(jié)直腸癌組織中cyclinD1主要呈細胞核表達,少數(shù)腫瘤細胞呈細胞質(zhì)表達。探討β-catenin通路相關(guān)基因在結(jié)直腸癌形成過程中的變化規(guī)律,將有助于研究腫瘤惡性表型多樣性的分子機

4、制。同時也應(yīng)認識到,人體是一個由多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交織成網(wǎng)絡(luò)、共同作用的有機整體,在研究β-catenin/Wnt途徑的同時,研究其他途徑的作用以及β-catenin/Wnt通路與其他因素之間的相互影響,將為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制提供一個新的解釋。
　　 RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究提供了一種新的、高效和特異的功能基因組研究策略,已經(jīng)應(yīng)用于功能基因組學(xué)、藥物靶點篩選和細胞信號傳導(dǎo)通

5、路分析等方面。
　　 本研究采用RNAi技術(shù)建立PRL-3和CDH-22雙基因表達下調(diào)的結(jié)直腸癌細胞模型,然后對其生物學(xué)特性的改變進行了初步的研究,通過比較其與同一親本來源的對照組細胞的形態(tài)、生物學(xué)特性、基因表達、蛋白差異等,探討PRL-3、CDH22與β-catenin/Wnt信號通路相關(guān)基因的相互作用,本研究有助于更深入了解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　 方法：
　　 1.靶向人CDH22基因RNAi慢病毒的

6、包裝、滴度測定2.慢病毒對SW480/PRL-3-細胞的二次感染將5×104個SW480/PRL-3-細胞接種于24孔板,37℃,5％CO2培養(yǎng),16h后其融合達60％-70％,用靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒以MOI為40感染細胞,添加polybrene,終濃度為8mg/ml。28h后去除病毒液,更換為含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 3.有限稀釋法獲得單克隆細胞株,對所得的各單克隆細胞株進行擴大

7、培養(yǎng)4.應(yīng)用熒光定量PCR及Westernblot檢測各克隆PRL-3及CDH22基因mRNA和蛋白的表達水平,綜合二者結(jié)果,鑒定出在mRNA及蛋白表達水平PRL-3及CDH22基因均顯著降低的克隆株,從而建立PRL-3和CDH22雙基因表達沉默的結(jié)直腸癌細胞模型,命名為SW480/PRL-3-/CDH22-。
　　 5.細胞蠟塊、流式細胞術(shù)、MTT法、比較SW480/PRL-3-/CDH22-與對照組SW480、SW480/M

8、ock、SW480/PRL-3.在細胞形態(tài)、細胞生長周期、細胞增殖能力方面的差異。
　　 6.免疫細胞化學(xué)檢測SW480/PRL-3-/CDH22-及其同一親本來源的對照組細胞株β-catenin/Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢病毒滴度測定收集病毒上清液,測定慢病毒的病毒滴度為8×105U/ml。
　　 2.細胞二次感染后進行克隆化培養(yǎng):經(jīng)有限稀釋法共獲得17個單克隆細胞

9、株,對所得的各單克隆細胞株進行擴大培養(yǎng)。
　　 3.PRL-3和CDH22雙基因表達沉默的結(jié)直腸癌細胞模型的建立及鑒定熒光定量PCR的結(jié)果顯示,挑取的各個單克隆都有不同程度CDH22基因的表達,通過公式計算,發(fā)現(xiàn)克隆2的干擾效率最高,表達量僅為對照的25％,即干擾效率為75％,其次是克隆1,表達量僅為對照的27％,即干擾效率為73％。熒光定量PCR結(jié)果顯示,挑取的各個單克隆均有不同程度PRL-3基因的表達,通過公式計算,發(fā)現(xiàn)克隆

10、4的干擾效率最高,表達量僅為對照的27％,即干擾效率為73％,其次是克隆1,表達量僅為對照的30％,即干擾效率為70％。通過熒光定量PCR初步得到4個可能符合實驗預(yù)期目的克隆株。
　　 WesternBlot進一步檢測這4個克隆株P(guān)RL-3及CDH22蛋白表達水平。綜合考慮熒光定量PCR、WesternBlot的結(jié)果,證實PRL-3及CDH22穩(wěn)定表達敲低的細胞克隆為克隆1,命名為SW480/PRL-3-/CDH22-。

11、　　 4.PRL-3和CDH22雙基因表達抑制的結(jié)直腸癌細胞的體外生物學(xué)特性的改變細胞蠟塊HE染色顯示:SW480/PRL-3-較SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock細胞胞漿豐富,細胞連接緊密,SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480、SW480/Mock3組細胞之間差異不顯著。應(yīng)用MTT法,我們檢測SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-、SW480/PRL-3-/CD

12、H22-細胞體外增殖能力,經(jīng)析因方差分析,四組差異具有顯著性(F=952.067,P=0.000)；經(jīng)LSD法多重比較,結(jié)果表明,SW480細胞增殖速度最快,SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-細胞次之,而SW480/PRL-3-細胞的增殖速度最慢。應(yīng)用流式細胞術(shù)分析細胞周期變化,SW480、SW480/Mock、SW480/PRL-3-/CDH22-及SW480/PRL-3-四種細胞的S期細胞平均比例分別為46

13、.6％、38.3％、30.9％和20.8％,統(tǒng)計分析結(jié)果顯示四種細胞的S期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.994,P=0.000)。SW480/PRL-3-細胞大部分阻滯在G1期,S期所占比例明顯減少。
　　 5.PRL-3和CDH22雙基因表達抑制的結(jié)直腸癌細胞及對照組細胞株β-catenin/Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達情況細胞免疫化學(xué)實驗顯示:
　　 1)SW480及SW480/Mock細胞E-cadherin在胞膜

14、表達呈不同程度缺失；
　　 SW480/PRL-3-/CDH22-細胞胞膜呈間斷性或異位表達,但并未出現(xiàn)明顯的膜表達缺失；SW480/PRL-3-細胞幾乎所有細胞E.cadherin成明顯的胞膜著色。
　　 2)SW480及SW480/Mock細胞β-catenin膜表達缺失明顯；SW480/PRL-3-/CDH22-細胞β-catenin從細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核膜及核周區(qū)域；SW480/PRL-3-細胞β-catenin重

15、新定位于細胞膜。
　　 3)CyclinD1陽性著色定位于細胞核。SW480及SW480/Mock細胞約85％的細胞CyclinD1呈核陽性表達,SW480/PRL-3-/CDH22-細胞約50％細胞呈核陽性表達,SW480/PRL-3-細胞約30％的細胞呈核陽性表達。
　　 4)4組細胞株CK均呈細胞膜陽性表達,無顯著差異。
　　 5)4組細胞株Vimentin均未見陽性表達。
　　 6)Gsk-3β在

16、4組細胞中表現(xiàn)為胞漿表達。其表達強度依次為:SW480/PRL-3-/CDH22-、SW480/PRL-3-、SW480/mock、SW480。
　　 結(jié)論：
　　 1.轉(zhuǎn)染一種基因慢病毒干擾載體的細胞株可再次接受靶向另一基因干擾序列的慢病毒顆粒的轉(zhuǎn)染,為研究慢病毒二次感染細胞并穩(wěn)定干擾各靶基因的表達提供有實用價值的實驗方法。
　　 2.成功建立PRL-3和CDH22雙基因表達抑制的結(jié)直腸癌細胞模型。
　　

17、 3.PRL-3、CDH22表達呈現(xiàn)不同水平時,Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達強度及部位發(fā)生改變。單獨下調(diào)PRL-3基因,CDH22表達上調(diào),細胞株細胞膜E-cadherin恢復(fù)連續(xù)線性表達,細胞質(zhì)或細胞核中的β-catenin重新定位于細胞膜,細胞核cyclinDl低表達。細胞之間連接變緊密,細胞增殖相對減慢,細胞阻滯在G1期,S期所占比例明顯減少。
　　 4.PRL-3基因可通過下調(diào)CDH22表達而誘導(dǎo)