1、目的：1、應(yīng)用高敏度小張力膜狀生物材料力學(xué)性能測定儀檢測不同支架材料和不同成纖維細(xì)胞數(shù)量的組織工程真皮的抗張強(qiáng)度。2、研究體外分離、培養(yǎng)、凍存人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的有效方法以獲得大量人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，探討其為構(gòu)建含血管的組織工程皮膚提供種子細(xì)胞的可能性。3、研究組織工程皮膚培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的分泌情況。4、檢測復(fù)方殼多糖組織工程真皮條件培養(yǎng)基促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。 方法：1、分別培養(yǎng)含有不同數(shù)量成纖維細(xì)

2、胞的膠原凝膠和復(fù)方殼多糖真皮替代物，15天后檢測抗張強(qiáng)度。2、新鮮臍帶內(nèi)灌注膠原酶消化，獲得內(nèi)皮細(xì)胞，用含20％胎牛血清的M199液進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)合Ⅷ因子免疫組化鑒定細(xì)胞來源。內(nèi)皮細(xì)胞加入10％甘油的凍存液，分別置于液氮保存1周和4周，復(fù)蘇后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，繪制生長曲線。3、收集不同時相的單層成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液、膠原凝膠真皮替代物(膠原凝膠DE)、膠原凝膠皮膚替代物(膠原凝膠SE)、復(fù)方殼多糖真皮替代物(復(fù)方殼多糖D

3、E)、復(fù)方殼多糖皮膚替代物(復(fù)方殼多糖SE)培養(yǎng)液樣本，雙抗體夾心ELISA法測定其中VEGF分泌量。4、配制4種不同條件培養(yǎng)基：含10％DMEM的無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、10％單層成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、10％復(fù)方殼多糖組織工程真皮培養(yǎng)液的無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和20％復(fù)方殼多糖組織工程真皮培養(yǎng)液的無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，[3H]-TdR摻入法測量其促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)果：1、組織工程真皮抗張強(qiáng)度隨成纖

4、維細(xì)胞數(shù)量增多而增強(qiáng)(p＜0.01)，復(fù)方殼多糖組織工程真皮的抗張強(qiáng)度高于膠原凝膠真皮(p＜0.01)。2、臍靜脈內(nèi)灌注膠原酶法可獲取高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，與未凍存細(xì)胞相比，復(fù)蘇的細(xì)胞活力保持在80％以上，復(fù)蘇后生長曲線與未凍存細(xì)胞相似。3、成纖維細(xì)胞(FB)在三維培養(yǎng)時分泌的VEGF明顯高于其單層培養(yǎng)時的分泌量，復(fù)方殼多糖組織工程皮膚VEGF的分泌量又高于膠原凝膠組織工程皮膚。大多數(shù)培養(yǎng)液中VEGF含量在48小時內(nèi)增長最快。4、復(fù)方殼多糖

5、組織工程真皮條件培養(yǎng)基促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用高于對照組和單層成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基，且其促進(jìn)作用呈劑量依賴性。 結(jié)論：組織工程真皮抗張強(qiáng)度與成纖維細(xì)胞數(shù)量成正比，殼多糖、透明質(zhì)酸和6-硫酸軟骨素等能顯著提高組織工程真皮的抗張強(qiáng)度。復(fù)方殼多糖真皮替代物具有良好的抗張強(qiáng)度，為臨床應(yīng)用提供穩(wěn)定機(jī)械性能。臍靜脈灌注酶消化法可獲取大量高純度的內(nèi)皮細(xì)胞。凍存的內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后仍保持較高的體外增殖能力，可作為制備含血管的組織工程皮膚的種子細(xì)