1、第一部分一個(gè)新的成骨細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)microRNA的克隆及表達(dá)分析
　　 目的:查找新的小鼠成骨細(xì)胞特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)的microRNA(migNA),并對(duì)其在多個(gè)組織器官和細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行研究。
　　 方法:首先提取小鼠成骨細(xì)胞的小分子RNA,經(jīng)過(guò)Poly(A)加尾并連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收,連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建小分子RNA的cDNA文庫(kù),最后進(jìn)行菌落PCR,得

2、到的陽(yáng)性克隆測(cè)序后選取19-26 nt大小的RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析確定新的miRNA。用Northern印跡雜交檢測(cè)新的miRNA在小鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨、肝臟、心臟、肺、腎臟、大腦、脂肪、脾及骨骼肌的表達(dá)情況。用BMP-2誘導(dǎo)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,Northern印跡雜交檢測(cè)miRNA在此過(guò)程中的表達(dá)模式。
　　 結(jié)果:共克隆得到162個(gè)小分子RNA,有68個(gè)為miRNAs,包括2個(gè)新的miRNAs,其中1個(gè)提交mi

3、RBase數(shù)據(jù)庫(kù)后命名為miR-2861。miR-2861位于小鼠第2條染色體,在人類(lèi)基因組中存在保守性。miR-2861在小鼠成骨細(xì)胞及骨高表達(dá),在肝臟表達(dá)較低,
　　 在其他組織和破骨細(xì)胞不表達(dá)。miR-2861在ST2細(xì)胞不表達(dá),BMP-2誘導(dǎo)ST2向成骨細(xì)胞分化12h后可以檢測(cè)到miR-2861表達(dá),并隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)逐漸增加。
　　 結(jié)論:首次構(gòu)建了小鼠成骨細(xì)胞小分子RNA的cDNA文庫(kù)。首次發(fā)現(xiàn)一

4、個(gè)新的成骨細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的miRNA-miR-2861。MiR-2861在小鼠與人之間具有保守性,其表達(dá)隨著成骨細(xì)胞分化的進(jìn)展而逐漸升高,提示其可能參與了成骨細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程。
　　 第二部分 miR-2861對(duì)成骨細(xì)胞分化影響的研究
　　 目的:研究miR-2861在小鼠基質(zhì)細(xì)胞ST2和原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)向成骨細(xì)胞分化中的作用。
　　 方法:根據(jù)miR-2861前體序列設(shè)計(jì)引物,退火后連接至pSil

5、encer4.1-CMV puro載體,構(gòu)建miR-2861的表達(dá)載體pre-miR-2861。將pre-miR-2861分別轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrowstromal cells,BMSCs),造成miR-2861過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,隨后予300ng/ml BMP-2誘導(dǎo)分化,觀察成骨細(xì)胞分化指標(biāo)變化。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)硝基苯酚釋放獲得,骨鈣素(Os

6、teocalcin,OC)用放射免疫測(cè)定法測(cè)定,細(xì)胞鈣沉積量用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法檢測(cè)。Westem雜交和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)Runx2蛋白和mRNA表達(dá)的變化。用2'-O-methyl修飾的反義寡核苷酸anti-miR-2861瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞和BMSCs,同樣方法檢測(cè)ALP活性、OC分泌以及細(xì)胞中鈣沉積量變化,Runx2蛋白和mRNA表達(dá)分別用Western雜交和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染用pSilen

7、cer4.1CMV puro構(gòu)建的miR-2861表達(dá)載體pre-miR-2861能夠在細(xì)胞中穩(wěn)定地高表達(dá)miR-2861。(2)miR-2861過(guò)表達(dá)促進(jìn)ST2和BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的ALP活性增高和OC分泌,提高Runx2蛋白表達(dá),而不影響Runx2 mRNA水平。ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR-2861能夠增加細(xì)胞中的鈣沉積量(3)抑制miR-2861隆低ST2和BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的ALP活性,減少OC分泌,降

8、低BMP-2誘導(dǎo)引起的Runx2蛋白表達(dá)升高,但不影響Runx2 mRNA水平,轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞5天后,鈣沉積含量較對(duì)照組降低。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了miR-2861表達(dá)載體,過(guò)表達(dá)miR-2861可以促進(jìn)ST2和BMSCs向成骨細(xì)胞分化,抑制miR-2861能夠延緩ST2和BMSCs向成骨細(xì)胞分化。
　　 第三部分miR-2861調(diào)控成骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　 目的:預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-2861作用的靶基因,闡

9、明miR-2861促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
　　 方法:用多個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析得到miR-2861作用的靶基因。PCR擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)在內(nèi)的靶基因編碼序列(coding sequence,CDS),產(chǎn)物連接到pGL3載體,構(gòu)建野生型靶基因CDS熒光素酶報(bào)告基因載體。以此為模板,用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒在靶位點(diǎn)中引入兩個(gè)堿基突變,構(gòu)建突變型靶基因CDS熒光素酶報(bào)告基因載

10、體。將這兩個(gè)載體分別與pre-miR-2861共同轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性變化以證實(shí)該靶基因是否為miR-2861作用的靶基因。ST2細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-2861,觀察miR-2861對(duì)靶基因表達(dá)的影響,Western雜交和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)靶基因蛋白和mRNA水平的變化,明確miR-2861對(duì)靶基因的調(diào)控作用。PCR擴(kuò)增靶基因CDS全長(zhǎng)cDNA,連接到pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建野生型靶基因表達(dá)載體,以此為模板,

11、用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒在靶位點(diǎn)中引入兩個(gè)堿基突變,構(gòu)建突變型靶基因表達(dá)載體,這兩個(gè)載體分別與pre-miR-2861或miR-C共同轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞,加BMP-2誘導(dǎo)分化,觀察ALP活性和靶基因蛋白表達(dá),ALP活性用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)硝基苯酚釋放獲得,靶基因蛋白表達(dá)用Western雜交檢測(cè)。
　　 結(jié)果:(1)軟件預(yù)測(cè)HDAC5為miR-2861作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染m

12、iR-C對(duì)照組相比,miR-2861表達(dá)組HDAC5 CDS的熒光素酶活性顯著下降,而轉(zhuǎn)染突變型HDAC5 CDS的熒光素酶活性則無(wú)明顯變化。(3)單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-2861可以降低HDAC5蛋白水平,而對(duì)HDAC5 mRNA無(wú)影響。(4)pre-miR-2861與野生型HDAC5 CDS表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染可以增加ALP活性,降低HDAC5蛋白表達(dá),而pre-miR-2861與突變型HDAC5 CDS表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染則不會(huì)產(chǎn)生這種作用。