1、白藜蘆醇能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，以劑量依賴的方式提高堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶活性。其在明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，能抑制脂肪細(xì)胞的分化，目前發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以激活SIRT1，而后者又能夠抑制脂肪的關(guān)鍵調(diào)控因子PPAR-γ。但是目前白藜蘆醇促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的具體機(jī)制尚不清楚。 從骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞受到一系列激素和局部因子的調(diào)控，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路起著非常重要的作用。Wnts蛋白是一類分泌型糖蛋

2、白，調(diào)控包括骨在內(nèi)的很多器官和組織的生長(zhǎng)和發(fā)育。其功能是與其特異性受體卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5結(jié)合，進(jìn)而激活Wnt信號(hào)通路，包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。當(dāng)缺少Wnt蛋白時(shí)，β-catenin可以被CK1和GSK-3β持續(xù)磷酸化，并發(fā)生泛素化降解；而當(dāng)Wnt蛋白存在時(shí)，沒有被磷酸化的β-catenin穩(wěn)定地累積增多并進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，通過與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)。近年發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路

3、中的某些基因的突變導(dǎo)致骨形成異常，例如，LRP5功能喪失性突變可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，功能獲得性突變能夠?qū)е赂吖橇?。與人類似，小鼠的Lrp5缺陷同樣會(huì)導(dǎo)致骨形成和成骨細(xì)胞增殖的下調(diào)，而攜帶獲得性功能突變的轉(zhuǎn)基因小鼠的成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡減少，骨密度明顯升高。 鑒于Wnt/β-catenin在成骨調(diào)控中的重要作用，對(duì)Wnt信號(hào)通路的各個(gè)環(huán)節(jié)的干預(yù)，成為治療骨質(zhì)疏松新的藥物靶點(diǎn)。如國外研究者成功的利用氯化鋰抑制GSK-3β的活性，激活W

4、nt信號(hào)通路的下游分子，抑制β-catenin的泛素化降解、使其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積增多，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，引起一系列下游相關(guān)基因的表達(dá)改變，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。為此，本研究以Wnt/β-catenin為切入點(diǎn)，探討白藜蘆醇促進(jìn)骨髓間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制。 第一部分 白藜蘆醇促進(jìn)小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化 為了明確白藜蘆醇促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，我們采用成骨條件培養(yǎng)基和白藜蘆醇

5、誘導(dǎo)小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞系ST2向成骨細(xì)胞分化。以成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物堿性磷酸酶和晚期標(biāo)志物骨鈣素以及成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2做為檢測(cè)標(biāo)志，分析了白藜蘆醇對(duì)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響，取得了以下結(jié)果： 1.白藜蘆醇可以明顯升高ST2細(xì)胞的ALP活性。在濃度為5μM到50μM間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，高的濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出毒性作用。 2.采用熒光定量PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2發(fā)現(xiàn)，10μM白藜蘆醇處理

6、ST2細(xì)胞能明顯增加Runx2基因表達(dá)。 3.采用定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，10μM白藜蘆醇能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的晚期標(biāo)志物OCN的表達(dá)。 以上研究結(jié)果表明白藜蘆醇能促進(jìn)小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞ST2向成骨細(xì)胞分化，為下一步研究其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 由于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成中起重要作用，為了揭示白藜蘆醇介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化作用的分子機(jī)制，本部分圍繞Wnt信號(hào)通路分析白藜蘆醇促

7、進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制，取得了以下結(jié)果： 1.白藜蘆醇能增加ST2細(xì)胞中總β-catenin和核β-catenin。 β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，是轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白TCF/LEF的共激活因子。因此，我們首先檢測(cè)了白藜蘆醇處理對(duì)ST2細(xì)胞β-catenin總量及其亞細(xì)胞分布的影響。發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理后，細(xì)胞β-catenin的總量和在細(xì)胞核內(nèi)的分布呈現(xiàn)劑量依賴性的升高，證明白藜蘆醇可以使β-catenin在ST

8、2細(xì)胞核中累積。 2.白藜蘆醇促進(jìn)β-catenin靶基因轉(zhuǎn)錄。 β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控Wnt信號(hào)通路的靶基因表達(dá)。為分析白藜蘆醇對(duì)Wnt信號(hào)通路靶基因的作用，我們采用帶有TCF結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(TOPFLASH和陰性對(duì)照FOPFLASH)檢測(cè)β-catenin-TCF依賴的基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以升高TOPFLASH的活性1.5至2.5倍，濃度在1μM有效，10

9、μM時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)。結(jié)果說明白藜蘆醇可以促進(jìn)含有TCF的啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄。 3.白藜蘆醇對(duì)小鼠Runx2基因啟動(dòng)子區(qū)域TCF轉(zhuǎn)錄因子的影響： 成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因的啟動(dòng)子包含有一個(gè)能夠被Wnt蛋白激活的TCF1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，通過對(duì)比分析野生型和突變?cè)撐稽c(diǎn)的報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過該基因的啟動(dòng)子TCF調(diào)控位點(diǎn)促進(jìn)Runx2轉(zhuǎn)錄。 4.白藜蘆醇激活Wnt信號(hào)通路不依賴于Lrp5。

10、 Lrp5是Wnt的共受體，為明確白藜蘆醇促進(jìn)成骨細(xì)胞分化是否需要Lrp5參與，我們采用RNAi方法抑制Lrp5基因表達(dá)，分析了Lrp5在白藜蘆醇促進(jìn)成骨細(xì)胞分化中的作用。 首先我們構(gòu)建了Lrp5干擾載體，分析發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)Lrp5干擾載體的細(xì)胞系Lrp5mRNA水平明顯降低，成骨相關(guān)的部分標(biāo)志基因表達(dá)也有明顯的下調(diào)。 之后我們對(duì)比分析了白藜蘆醇對(duì)穩(wěn)定表達(dá)干擾載體和對(duì)照載體細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能明顯升高兩種細(xì)胞的ALP

11、的活性；向以上兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染報(bào)告基因系統(tǒng)也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能增加兩種細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)。以上結(jié)果說明白藜蘆醇促進(jìn)成骨細(xì)胞分化不依賴于Lrp5，其作用靶點(diǎn)很可能位于Lrp5下游。 第三部分 白藜蘆醇通過ERK促使GSK-3β的磷酸化 第二部分研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過增加細(xì)胞核內(nèi)β-catenin積累而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。由于β-catenin主要通過GSK-3β等的作用而被磷酸化進(jìn)而被泛素化，而GSK-3β激酶活性能被

12、其自身的磷酸化所抑制。因此，本部分對(duì)白藜蘆醇處理后細(xì)胞內(nèi)GSK-3β的磷酸化狀態(tài)及其上游調(diào)控分子進(jìn)行了分析。取得了以下結(jié)果： 1.10μM白藜蘆醇處理細(xì)胞能夠明顯升高GSK-3β的Ser9位的磷酸化水平，結(jié)果提示：白藜蘆醇通過磷酸化降低GSK-3β的激酶活性，引起了β-catenin的穩(wěn)定累積入核過程。 2.目前普遍認(rèn)為，GSK-3β可以被P13-K/Akt，MAPK或者ERK磷酸化，另外一些小分子也會(huì)導(dǎo)致GSK-3β的

13、磷酸化，如氯化鋰。根據(jù)白藜蘆醇的生物學(xué)作用，我們首先檢測(cè)了ERK通路，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以明顯的促進(jìn)Erk1/2的磷酸化，而對(duì)總Erk1/2沒有影響，不僅如此，ERK通路的特異性抑制劑PD98059能夠抑制白藜蘆醇導(dǎo)致的Erk1/2磷酸化的同時(shí)，抑制GSK-3β的磷酸化。另外，PD98059能夠抑制白藜蘆醇導(dǎo)致的β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的累積。結(jié)果提示白藜蘆醇激活ERK通路，導(dǎo)致了GSK-3β活性的抑制，從而引起它對(duì)Wnt信號(hào)通路下游抑

14、制作用的喪失，Wnt信號(hào)通路狀態(tài)的改變最終引起了間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。 第四部分 白藜蘆醇可以通過對(duì)Sirt1和PPAR-γ的作用促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化 近年的文獻(xiàn)報(bào)道，Sirt1的激活可以抑制PPAR-γ2，從而抑制間質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。因此，我們分析了白藜蘆醇對(duì)Sitt1表達(dá)的調(diào)控作用。 1.白藜蘆醇促進(jìn)人和小鼠SIRT1蛋白表達(dá)。 研究表明白藜蘆醇可以模擬限制能量攝取

15、的作用，激活Sir2。我們檢測(cè)了白藜蘆醇處理后的人U2OS細(xì)胞、小鼠ST2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠明顯升高U2OS、ST2細(xì)胞中SIRT1的蛋白水平。 2.白藜蘆醇促進(jìn)SIRT1的表達(dá)需要ERK和p53的磷酸化。 我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇升高SIRT1表達(dá)的同時(shí)，p53蛋白上Ser15位的磷酸化水平也升高，而且都可以被ERK通路的抑制劑PD98059所抑制。這些結(jié)果表明，白藜蘆醇通過激活ERK通路，作用于Wnt/β-catenin

16、，并促進(jìn)Sirt1和p53的上調(diào)，共同對(duì)成骨細(xì)胞分化起一定的作用。 3.白藜蘆醇抑制ST2細(xì)胞和大鼠脂肪組織中PPAR-γ基因的表達(dá)。 近年研究表明，在成骨細(xì)胞分化過程中PPAR-γ通過不同于Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的途徑促進(jìn)β-catenin的泛素化降解，抑制PPAR-β會(huì)抑制間質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，從而增加其向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)PPAR-γ促進(jìn)成熟的脂肪動(dòng)員。為了進(jìn)一步了解Res促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的多重機(jī)制，我們分析了Res

17、對(duì)PPA-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。在ST2細(xì)胞中加入梯度濃度的Res，提取RNA，通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPAR-γ基因的轉(zhuǎn)錄受到Res的濃度依賴的負(fù)調(diào)控。 另外我們選擇了成年大鼠進(jìn)行白藜蘆醇的喂飼，分別給予低、中和高三個(gè)濃度的白藜蘆醇灌胃，取大鼠腹部脂肪組織，檢測(cè)PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能明顯抑制大鼠脂肪組織中PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平。 綜上所述，我們的研究結(jié)果提示白藜蘆醇促進(jìn)骨髓間質(zhì)細(xì)胞S