1、目的：
　　關(guān)節(jié)軟骨缺損或病變在臨床上多發(fā)。究其原因，主要是源于外部創(chuàng)傷以及內(nèi)在與年齡增長等因素相關(guān)的軟骨退化。軟骨組織由于其缺乏血管，缺少相應(yīng)的修復(fù)細(xì)胞及因子，導(dǎo)致自身修復(fù)能力有限，一旦出現(xiàn)軟骨缺損即容易發(fā)展成為永久病變。近年來，用于軟骨修復(fù)的組織工程技術(shù)取得了巨大成就。間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，因其來源廣泛，易于分化，在軟骨組織工程重建過程中使用最為頻繁。但如何誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞，同時(shí)在分化后維持軟骨細(xì)胞形態(tài)，

2、使之不繼續(xù)肥大分化仍是目前所面臨的問題。因此，了解軟骨細(xì)胞分化進(jìn)程，調(diào)控軟骨細(xì)胞形態(tài)在軟骨修復(fù)及骨組織工程領(lǐng)域尤為重要。
　　本研究利用已建立的體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化模型，探究HDAC4對干細(xì)胞向軟骨前體細(xì)胞分化及成熟軟骨細(xì)胞向肥大化軟骨分化的影響，為體外構(gòu)建組織工程軟骨及維持軟骨形態(tài)提供理論依據(jù)。另外，我們利用體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞分化模型，探究白藜蘆醇對軟骨細(xì)胞終末肥大分化進(jìn)程的影響，有助進(jìn)一步了解軟骨細(xì)胞

3、終末分化過程，為體外組織工程骨構(gòu)建提供新的調(diào)控分子。
　　方法和內(nèi)容：
　　本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，針對干細(xì)胞軟骨化和軟骨細(xì)胞肥大化過程研究不同因素對分化進(jìn)程及細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　一．HDAC4通過與HIF1α相互作用促進(jìn)MSCs軟骨分化
　　（1）過表達(dá)及干擾表達(dá)HDAC4間充質(zhì)干細(xì)胞（C3H10T1/2，MSCs）系的構(gòu)建；
　　利用過表達(dá)及干擾表達(dá)HDAC4慢病毒構(gòu)建MSCs實(shí)驗(yàn)組，并使用CCK8進(jìn)行細(xì)

4、胞活力測定。將不同組MSCs分別培養(yǎng)于含TGF-β3的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中14天，期間使用qPCR及Western blot的方法鑒定軟骨相關(guān)標(biāo)志基因（Col II、Sox9）表達(dá)情況。
　?。?）過表達(dá)及干擾表達(dá)HDAC4對MSCs軟骨分化進(jìn)程的影響；
　　自MSCs軟骨誘導(dǎo)開始，每7天回收實(shí)驗(yàn)各組誘導(dǎo)細(xì)胞mRNA及全蛋白。通過qPCR和Western blot的方法檢測軟骨化（Col II、Sox9）及肥大化（Runx2、C

5、ol X、Mef2C）相關(guān)基因及蛋白表達(dá)情況。并使用甲苯胺藍(lán)染色評價(jià)細(xì)胞分化程度。
　?。?）HDAC4促進(jìn)MSCs軟骨分化的機(jī)制；
　　通過qPCR和Western blot的方法檢測各組MSCs誘導(dǎo)過程中HIF1α表達(dá)情況；Duolink-PLA法檢測HDAC4與HIF1α相互作用關(guān)系；使用HIF1α抑制劑（2-Me2OE2）及激活劑（IOX2）探究HDAC4-HIF1α相互作用對細(xì)胞分化進(jìn)程影響；使用HDAC4入核抑制

6、劑（LB-100）探究HDAC4對HIF1α核積累的影響。
　　二．白藜蘆醇促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化的作用機(jī)制研究
　?。?）體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞（ATDC5）肥大化培養(yǎng)體系的建立及白藜蘆醇安全濃度的確定；
　　使用含 T3的軟骨細(xì)胞肥大化培養(yǎng)基中誘導(dǎo) ATDC5細(xì)胞14天，即認(rèn)為ATDC5細(xì)胞進(jìn)入肥大化階段。將ATDC5細(xì)胞置于含不同濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、20μM）白藜蘆醇的肥大化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用CCK8法

7、檢測24h及48h白藜蘆醇對ATDC5細(xì)胞活性的影響。
　?。?）白藜蘆醇對軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程的影響；
　　采用甲苯胺藍(lán)法檢測肥大化誘導(dǎo)14天后，實(shí)驗(yàn)組（1μM RES）及對照組細(xì)胞外粘多糖表達(dá)情況；qPCR和Western blot檢測肥大相關(guān)基因在3、7、14天表達(dá)；免疫組化檢測肥大化標(biāo)志Col X和Runx2表達(dá)。
　　（3）白藜蘆醇促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化的機(jī)制；
　　qPCR檢測3、7、14天WNT、IHH及

8、PI3K通路相關(guān)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　一．HDAC4通過與HIF1α相互作用促進(jìn)MSCs軟骨分化
　?。?）構(gòu)建過表達(dá)及抑制表達(dá)HDAC4間充質(zhì)干細(xì)胞（C3H10T1/2，MSCs）系；
　　慢病毒轉(zhuǎn)染陽性率隨MOI值升高而升高，綜合考慮CCK8測得細(xì)胞活力差異，最終使用MOI500進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；與對照組（Lv.Control）相比，過表達(dá)組（Lv.HDAC4）細(xì)胞內(nèi)HDAC4的mRNA及蛋白水平均顯著

9、提升。同樣的，與干擾對照組（si.Control）相比，干擾組（si.HDAC4）HDAC4表達(dá)量降低；qPCR檢測誘導(dǎo)期間軟骨標(biāo)志基因表達(dá)水平下降。
　?。?）研究過表達(dá)及干擾表達(dá)HDAC4對MSCs軟骨分化進(jìn)程的影響；
　　在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，Lv.HDAC4組中Col II及Sox9表達(dá)水平均顯著提升；同時(shí)，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果也顯示Lv.HDAC4組MSCs細(xì)胞外多糖分泌量更多。而si.HDAC4組細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中軟骨

10、分化標(biāo)志基因（Col II、Sox9）表達(dá)受到抑制；si.HDAC4組中肥大化標(biāo)志基因Runx2、Col X及Mef2C表達(dá)在分化末期較對照組（si.Control）均增加。
　?。?）探究HDAC4促進(jìn)MSCs軟骨分化的機(jī)制；
　　與Lv.Control相比，Lv.HDAC4組細(xì)胞內(nèi)HIF1α含量更高，而si.HDAC4組則較si.Control組更少；免疫熒光染色結(jié)果與Western Blot結(jié)果一致，且si.HDAC4

11、組中HIF1α主要集中于核內(nèi)，而Lv.HDAC4組中HIF1α在胞漿內(nèi)也有廣泛分布；Duolink-PLA結(jié)果顯示HDAC4與HIF1α間存在直接相互作用；在Lv.HDAC4組中使用HIF1α抑制劑（2-Me2OE2）后，軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)下降；而在si.HDAC4組中使用HIF1α激活劑（IOX2）后，Col II、Sox9表達(dá)升高；另外，在Lv.HDAC4組中使用HDAC4入核抑制劑（LB-100），HIF1α的核積累量明顯降低；

12、
　　二．白藜蘆醇促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化的作用機(jī)制研究
　?。?）確定白藜蘆醇安全濃度
　　在軟骨細(xì)胞肥大化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)14天，通過檢測肥大化相應(yīng)基因表達(dá)，即認(rèn)為ATDC5細(xì)胞進(jìn)入肥大化階段；CCK8法確定RES安全使用濃度為1μM；
　　（2）研究白藜蘆醇對軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程的影響
　　與對照組相比，在肥大化誘導(dǎo)14天后，RES組 ATDC5細(xì)胞肥大化水平明顯提升；RES組肥大化相關(guān)基因表達(dá)量在3、7、14天

13、時(shí)明顯增加；RES組免疫組化檢測Col X和Runx2表達(dá)較對照組升高。
　?。?）探究白藜蘆醇促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化的機(jī)制
　　qPCR結(jié)果顯示，WNT和IHH途徑中促肥大化因子β-catenin和GLI2的表達(dá)水平在RES組較對照組升高，而GLI3表達(dá)水平下降；FGF途徑中PI3K的表達(dá)水平較對照組沒有變化。
　　總結(jié)：
　　基于體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化模型，我們發(fā)現(xiàn)HDAC4通過與HIF1α直接相互作