1、惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤，其高度侵襲性導(dǎo)致治療十分困難、復(fù)發(fā)率高。豐富的新生血管是此腫瘤最為突出的間質(zhì)特點(diǎn)，這些新生血管是瘤細(xì)胞快速增殖、高度侵襲和復(fù)發(fā)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，深入研究血管生成機(jī)制、并有效阻抑血管新生對于惡性膠質(zhì)瘤的治療非常關(guān)鍵。 腫瘤血管生成由瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌的促血管生成因子和抑血管生成因子共同調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，V

2、EGF)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)是兩種重要的促血管生成因子，它們可以促進(jìn)腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及形成血管腔。近年研究表明，趨化因子受體CXCR4在腫瘤血管生成和侵襲中發(fā)揮重要作用。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達(dá)與膠質(zhì)瘤微血管密度及惡性程度呈正相關(guān)，提示此受體具有促膠質(zhì)瘤血管生成的作用。但是，CXCR4促膠質(zhì)瘤血管生成作用的機(jī)制和治療學(xué)意義尚需深入探討。 最近，腫瘤干細(xì)胞(cancer ste

3、m cells，CSCs)或稱腫瘤始動(dòng)細(xì)胞(tumor initiatingcells)因其獨(dú)特的生物學(xué)特性及在腫瘤中的重要作用已越來越受到重視。CSCs在腫瘤中含量極微，卻獨(dú)具自我更新、無限增殖、多向分化和重建腫瘤的能力，被認(rèn)為可能是腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、治療抵抗以及復(fù)發(fā)的根源。然而，這群CSCs在血管生成中所扮演的角色尚不清楚：它們是否始動(dòng)或參與了腫瘤血管生成過程？其分子機(jī)制如何？我們前期結(jié)果和國外的報(bào)道均提示膠質(zhì)瘤中的CSCs，即膠

4、質(zhì)瘤干細(xì)胞(gliomastem cells，GSCs)高分泌VEGF，IL-8等血管生成因子，其上游調(diào)控機(jī)制不明。最近，我們發(fā)現(xiàn)GSCs高表達(dá)CXCR4?；诖?，我們推測，GSCs高表達(dá)的CXCR4可能通過促進(jìn)VEGF和IL-8產(chǎn)生而發(fā)揮促血管生成作用。本研究中，我們首先觀察了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)及活化后促侵襲和血管生成因子產(chǎn)生的作用，并觀測我室自行合成的化合物諾帝對CXCR4介導(dǎo)的上述效應(yīng)的抑制作用；然后，

5、我們檢測了GSCs標(biāo)志物CD133和nestin在原代膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其移植瘤中的表達(dá)，并從中分離、鑒定出GSCs，研究了CXCR4在GSCs中的表達(dá)及其活化后促血管生成作用機(jī)制；最后，我們探討了拮抗CXCR4活化對GSCs移植瘤的治療作用。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.CXCR4活化促進(jìn)U87細(xì)胞遷移及產(chǎn)生VEGF和IL-8。①CXCR4在U87細(xì)胞之間表達(dá)強(qiáng)弱呈現(xiàn)非均一性。CXCR4配體CXCL12(25～100 ng/m

6、l)可引起細(xì)胞內(nèi)鈣流增加，效應(yīng)在50 ng/ml時(shí)達(dá)到最強(qiáng)。用CXCR4特異性拮抗劑AMD3100(1～10μM)預(yù)處理細(xì)胞，可抑制CXCL12誘發(fā)的胞內(nèi)鈣流。②CXCR4活化促進(jìn)U87細(xì)胞遷移。對照組U87細(xì)胞跨膜遷移細(xì)胞數(shù)為11.68±3.78個(gè)，3個(gè)高倍視野(3HPF)，而采用CXCL12(25～100 ng/ml)活化CXCR4后，跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)明顯增加，其中以50 ng/ml劑量組效應(yīng)最強(qiáng)，遷移細(xì)胞數(shù)為156.67±13.2

7、個(gè)/3HPF。1和10μM AMD3100均可抑制CXCR4活化誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。CXCR4促遷移效應(yīng)可能與其活化后誘導(dǎo)F-actin增加有關(guān)。③10～100 ng/ml CXCL12處理36 h均能促進(jìn)U87細(xì)胞分泌VEGF和IL-8，濃度為50 ng/ml時(shí)作用最強(qiáng)，50 ng/ml CXCL12處理12 h可促進(jìn)IL-8分泌，對VEGF分泌無影響，處理24～48 h可同時(shí)促進(jìn)IL-8和VEGF蛋白分泌和mRNA表達(dá)。1～10μMAM

8、D3100預(yù)處理能抑制CXCR4活化引起的VEGF和IL-8增加。 2.諾帝抑制U87細(xì)胞CXCR4表達(dá)及活化效應(yīng)。①25～100μM諾帝處理12 h能使CXCR4表達(dá)減弱，以100μM作用最強(qiáng)。100μM諾帝處理12、24、36、48 h，平均熒光強(qiáng)度分別為24.13±8.53、24.52±4.41、17.36±3.91和13.45±4.23，與對照組(38.54±11.42)相比CXCR4表達(dá)顯著降低(P<0.05)。27

9、mg/kg諾帝體內(nèi)治療能夠降低U87移植瘤CXCR4蛋白的表達(dá)。但是，諾帝處理并不影響CXCR4 mRNA表達(dá)。②25～100μM諾帝預(yù)處理能夠抑制CXCR4活化所引起的細(xì)胞遷移活性增加，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為99.67±9.45、82.67±7.02和54.33±8.62個(gè)/3HPF，與對照組(156.67±13.2個(gè)/3HPF)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此效應(yīng)與諾帝抑制CXCR4活化后誘導(dǎo)的F-actin增多有關(guān)。③諾帝對U8

10、7細(xì)胞CXCR4活化后的促VEGF和IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白分泌效應(yīng)均具有抑制作用。 3.人原代膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其移植瘤中均含有nestin+/CD133+GSCs。①人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、SHG-44、CHG-5及其相應(yīng)移植瘤均表達(dá)GSCs標(biāo)志物nestin和CD133。其中nestin的表達(dá)與腫瘤級別呈正相關(guān)，高級別膠質(zhì)瘤(III、I級)顯著高于低級別膠質(zhì)瘤(I、II級)，而CD133表達(dá)與

11、腫瘤級別無關(guān)。大部分CD133陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)nestin。②nestin+/CD133+細(xì)胞具有GSCs特性。CD133+細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中成球生長：所形成的細(xì)胞球表達(dá)nestin和CD133，經(jīng)誘導(dǎo)后能分化為表達(dá)GFAP、MBP和β-tubulin III的細(xì)胞，且能在體內(nèi)連續(xù)成瘤。③創(chuàng)建了4種簡便、易行的獲取腫瘤干細(xì)胞的方法，并應(yīng)用于GSCs的篩選。這些方法包括克隆分型篩選法、基于侵襲異質(zhì)性的篩選法、耐藥細(xì)胞篩選法和逐步添加

12、條件培養(yǎng)基篩選法。 4.GSCs優(yōu)勢性高表達(dá)CXCR4，此受體活化后介導(dǎo)GSCs誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤血管生成。 5.CXCR4特異性拮抗劑AMD3100抑制GSCs移植瘤生長和血管生成。①AMD3100治療1w時(shí)，腫瘤體積與空白對照組和PBS對照組無明顯差別。而后，AMD3100治療組移植瘤體積顯著小于對照組，觀察期截止時(shí)，AMD3100治療組移植瘤體積為0.23±0.06 cm3，與空白對照組(2.21±0.32 cm3)和P

13、BS對照組(2.16±0.37cm3)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，空白對照組與PBS對照組之間腫瘤體積無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>o.05)。②AMD3100治療后腫瘤微血管密度明顯降低，與PBS對照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AMD3100治療組移植瘤血管生成因子VEGF和IL-8的表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)。③AMD3100不影響GSCs移植瘤中CXCL12和CXCR4表達(dá)(P>0.05)。④AMD310

14、0治療組與對照組GSCs移植瘤中CD133+細(xì)胞和nestin+細(xì)胞比例無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 綜上所述，CXCR4活化可促進(jìn)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87遷移及產(chǎn)生血管生成因子，諾帝能夠抑制U87細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)及活化后的效應(yīng)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的CXCR4具有非均一性，優(yōu)勢表達(dá)于GSCs，后者存在于人原代膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其移植瘤中；CXCR4活化在介導(dǎo)GSCs誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤血管生成中起重要作用，而抑制CXCR4