1、目的:
　　本課題通過采用不同方法對肺炎鏈球菌進行血清分型，旨在找到較快速、準確、方便及經濟的分型方法，同時對本地區(qū)肺炎鏈球菌血清型的分布有個初步的了解。通過對肺炎鏈球菌5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、nanA)的攜帶及其mRNA轉錄水平情況的檢測，分析侵襲性與非侵襲性、不同血清型別和不同標本來源的肺炎鏈球菌的毒力基因的轉錄水平差異，探討其在侵襲性感染過程中的作用。
　　方法:
　　1.收集溫州醫(yī)科

2、大學附屬第二醫(yī)院2009年1月至2013年5月的痰液、膿液、血液、腦脊液、胸水等臨床標本，通過典型的菌落特征，Optochin敏感試驗，VITEK2 COMPACT型全自動細菌分析儀對收集到的標本進行鑒定和驗證。
　　2.分別采用莢膜腫脹試驗和連續(xù)多重PCR技術對鑒定后的肺炎鏈球菌進行血清分型，并比較兩種方法的一致性。
　　3.采用普通PCR方法對肺炎鏈球菌基因組DNA的5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、n

3、anA)進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
　　4.采用實時熒光定量PCR方法對肺炎鏈球菌5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、nanA)的mRNA轉錄水平進行檢測，以16S rRNA作為內參基因，計算采用2-ΔΔCT方法分析各毒力基因的轉錄水平差異。實驗分為侵襲性組與非侵襲性組。統(tǒng)計軟件采用Spss17.0，侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌毒力基因mRNA轉錄水平差異比較采用成組t檢驗，統(tǒng)計結果P＜0.05為差異有統(tǒng)

4、計學意義;相同血清型不同組別間、相同基因不同血清型之間及不同標本來源之間各毒力基因轉錄水平差異的比較均采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.收集到的112株菌均為肺炎鏈球菌，其中，侵襲性肺炎鏈球菌共52株，血液32株，腦脊液10株，膿液6株，胸水3株，尿液1株;非侵襲性肺炎鏈球菌共60株，均來自于痰液標本。
　　2.莢膜腫脹試驗，共檢出24個血清型/群，常見血清型有:19F、19A、

5、14、23F、6A、6B，其中有2株未分型;多重PCR方法，共檢出20個血清型/群，常見血清型有:6A/B、19F、19A、14、23F，其中有2株cpsA陰性，4株未分型;兩種血清分型方法的一致性一般，常見血清型分型中，兩者的一致性較高。
　　3.肺炎鏈球菌基因組DNA中5個毒力基因的攜帶情況:psaA98.2％(110/112); ply99.1％(111/112);lytA100％(112/112); cbpA98.2％(1

6、10/112); nanA99.1％(111/112)。
　　4.肺炎鏈球菌5個毒力基因mRNA的轉錄水平:經計算統(tǒng)計nanA、lytA、psaA和ply，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，4個毒力基因在侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉錄水平均存在差異;cbpA，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，在侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉錄水平不存在差異;分析19F、19A、14、6A/B、23F和3型各血清型之間毒力基因的轉錄水平差

7、異，經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)lytA在各血清型中的轉錄水平P＞0.05差異無統(tǒng)計學意義;3型中nanA、psaA、cbpA和ply的轉錄水平與其他血清型比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);在19F、19A、14、6A/B、23F和3型6種血清型/群中侵襲性組與非侵襲性組各毒力基因轉錄水平的比較中，19F和6A/B血清型中侵襲性組與非侵襲性組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義;不同標本來源血液和腦脊液中肺炎鏈球菌的轉錄水平，nanA、lytA

8、、psaA和ply，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，腦脊液來源的轉錄水平量高于血液來源的。
　　結論:
　　1.本院肺炎鏈球菌血清型以19F、19A、14、23F、6A和6B型為主，其中19F型最多。
　　2.在常見的血清分型中多重PCR技術可以替代傳統(tǒng)的莢膜腫脹試驗進行常規(guī)分型檢測。
　　3.肺炎鏈球菌基因組DNA中saA、ply、lytA，cbpA、nanA5個毒力基因普遍存在。
　　4.NanA、ly

9、tA、psaA和ply在侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉錄水平量明顯高于非侵襲性組，而cbpA的轉錄水平不存在差異且轉錄水平下調;psaA、ply、nanA和cbpA在3型中的轉錄水平高于其他血清型，3型的侵襲力高于其他血清型。
　　5.血液與痰液標本來源的肺炎鏈球菌毒力基因轉錄水平有一定差異但無統(tǒng)計學意義，腦脊液來源與血液，痰液比較，轉錄水平量明顯增高，且有統(tǒng)計學意義，腦脊液來源肺炎鏈球菌cbpA轉錄水平下調，而nanA、lytA、ps