1、牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體構(gòu)成牙齒的主體，受到外界刺激后牙髓中的牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞并分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，最終形成繼發(fā)性牙本質(zhì)保護(hù)牙髓。損傷修復(fù)的具體機(jī)制是目前牙髓生物學(xué)亟待闡明的關(guān)鍵問(wèn)題。細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE)是短整聯(lián)蛋白黏合性配體互動(dòng)糖蛋白(small integrin-binding

2、 ligand N-linked glycolproteins，SIBLINGs)蛋白家族的新成員，主要表達(dá)于骨組織、牙齒組織以及腎近球小管中，與體內(nèi)鈣磷平衡和牙體硬組織的形成礦化密切相關(guān)，是牙本質(zhì)發(fā)育缺陷的重要候選基因。本研究推測(cè)在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中，MEPE作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可能通過(guò)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響其他骨誘導(dǎo)因子的合成和分泌，調(diào)節(jié)DPSCs的增殖分化和牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的修復(fù)再生。本課題組前期研究檢測(cè)了人牙髓細(xì)胞(human

3、dental pulp cells，hDPCs)誘導(dǎo)分化過(guò)程中礦化標(biāo)志的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MEPE與牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)mRNA水平同步上調(diào)，與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)誘導(dǎo)分化的表達(dá)情況相似。因此，本研究擬檢測(cè)MEPE對(duì)hDPCs增殖、成牙本質(zhì)分化和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影響，揭示MEPE在牙髓損

4、傷修復(fù)中的作用機(jī)制。
　　 目的：研究MEPE對(duì)hDPCs增殖和成牙本質(zhì)分化能力的影響，揭示其在牙髓損傷修復(fù)中的功能。
　　 方法：
　　 ①采用酶消化組織塊法進(jìn)行hDPCs的原代培養(yǎng)；不同濃度rhMEPE(0、2.5、5、25、50、250、500ng/mL)作用hDPCs 1、2、3d，以0ng/mL組為對(duì)照組，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；不同濃度rhMEPE(0、5、10、50、100ng/mL)結(jié)合礦

5、化誘導(dǎo)hDPCs 21d，以未礦化組及0ng/mL組為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、DSPP、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、Collagen Ⅰ mRNA表達(dá)水平；選取rhMEPE最佳濃度結(jié)合礦化誘導(dǎo)hDPCs0、7、14、21d，以礦化0d為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表達(dá)水平。
　　 ②

6、構(gòu)建Ad5-MEPE-EGFP載體，測(cè)定病毒滴度；用不同MOI(100，200，500，1000，2000)Ad5-MEPE-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs48h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算平均轉(zhuǎn)染率，篩選最適MOI；以最適MOI轉(zhuǎn)染hDPCs 3、7、14、21d后，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western Blot檢測(cè)細(xì)胞MEPE表達(dá)。
　　 ③以最適MOI的Ad5-MEPE-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs 1、3、7、10d后，CCK

7、-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；轉(zhuǎn)染hDPCs 1、3、7、10、14、21d后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP活性；轉(zhuǎn)染hDPCs 7、14、21d后，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表達(dá)水平，Von Kossa染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 ①酶消化組織塊法可有效進(jìn)行hDPCs的原代培養(yǎng)；CCK-8結(jié)果顯示隨著rhMEPE作用時(shí)間延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組OD值升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；礦化誘導(dǎo)21d，各濃度組BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表達(dá)均較對(duì)照組(未礦化組及0ng/mL組)上調(diào)，與未礦化組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，除100 ng/mL組外(p＞0.05)，其他濃度組中BSP、DSPP、OCN、CollagenⅠ基因表達(dá)與0ng/mL組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；各實(shí)驗(yàn)組中以5ng/mL組作用最明顯，各目的基因表達(dá)較其他濃度組顯著性升高(p

9、＜0.05)；5ng/mL組礦化誘導(dǎo)7、14、21d，各基因表達(dá)量均較對(duì)照組上調(diào)，21d時(shí)達(dá)最大值(p＜0.05)。
　　 ②檢測(cè)Ad5-MEPE-EGFP病毒滴度為2.0×1010 IU/mL，EGFP表達(dá)量隨著MOI值增加而增高，根據(jù)平均轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞形態(tài)選取最適MOI=500用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其轉(zhuǎn)染效率為(80.204±1.589)％；轉(zhuǎn)染7d時(shí)細(xì)胞MEPE mRNA表達(dá)最高，隨后逐漸降低，在21d時(shí)未能檢測(cè)到MEPE mRN

10、A表達(dá)。Western Blot驗(yàn)證以上結(jié)果。
　　 ③CCK-8結(jié)果顯示Ad5-MEPE-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs1、3d后OD值均高于未轉(zhuǎn)染組，3d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，隨后OD值降低且低于未轉(zhuǎn)染組，10d時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)；在各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組ALP活性均高于未轉(zhuǎn)染組，10d時(shí)達(dá)到最大值；轉(zhuǎn)染后各目的基因表達(dá)量均較未轉(zhuǎn)染組上調(diào)，BSP mRNA在14d時(shí)表達(dá)最高，DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRN

11、A在7d時(shí)最高，且均較另外兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(14d和21d)顯著性上調(diào)(p＜0.05)，空白轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；Von Kossa染色示Ad5-MEPE-EGFP轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)大小不等的褐色礦化結(jié)節(jié)，21d時(shí)礦化結(jié)節(jié)數(shù)量最多，結(jié)節(jié)體積最大。
　　 結(jié)論：外源性rhMEPE及Ad5-MEPE-EGFP轉(zhuǎn)染均能促進(jìn)hDPCs增殖、BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表達(dá)上調(diào)和ALP活性升高，提示MEP