1、目的：
　　Nell-1(Nel-like molecule-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，它在成骨細胞的分化、骨形成和骨再生等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Nell-1在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過程中呈時空特異性表達，在牙胚發(fā)育的成牙本質(zhì)細胞分化過程中呈強陽性表達。初步推測Nell-1可能在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細胞分化過程中發(fā)揮作用。目前為止，Nell-1在成牙本質(zhì)細胞的分化及牙本質(zhì)形成過程中發(fā)揮的作用尚不明確，本實驗擬

2、通過體外試驗研究人重組Nell-1對人牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化的影響，以揭示Nell-1在牙髓細胞成牙本質(zhì)細胞樣細胞分化過程中發(fā)揮的作用。
　　材料和方法：
　　1、應(yīng)用改良酶消化法培養(yǎng)人牙髓細胞。
　　2、使用不同濃度的Nell-1蛋白(0、50 ng/ml、100 ng/ml、150ng/ml)作用于礦化誘導(dǎo)階段的人牙髓細胞，礦化第3d收集細胞蛋白并測定不同濃度Nell-1蛋白處理后人牙髓細胞的堿性磷酸酶(

3、alkaline phosphatase，ALP)活性。然后選取最佳顯效濃度的Nell-1蛋白處理牙髓細胞，培養(yǎng)3d、5d、7d，檢測Nell-1蛋白處理后的人牙髓細胞在不同礦化時間點的ALP活性。
　　3、使用最佳顯效濃度的Nell-1蛋白作用于人牙髓細胞，礦化0、6h、12h、24h，提取人牙髓細胞的總RNA和總蛋白。應(yīng)用Real-time PCR檢測與成牙本質(zhì)細胞分化的相關(guān)基因骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、牙本

4、質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dentine matrix protein-1， DMP-1)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和核心結(jié)合蛋白因子1(runt-related transcription factor1，Runx2)在不同礦化誘導(dǎo)時間點的mRNA水平表達差異性，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測OPN和DMP-1在蛋白水平的表達差異性。
　　結(jié)果：
　　1、用改良酶消化法成功培養(yǎng)人牙髓細胞，將狀態(tài)良好的第3代細胞

5、用于后續(xù)試驗。
　　2、使用濃度為0（空白對照）、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的Nell-1蛋白礦化誘導(dǎo)人牙髓細胞3d，發(fā)現(xiàn)50ng/ml Nell-1蛋白處理組與空白對照組的ALP活性沒有明顯差異;100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白處理組與空白對照組相比，ALP活性明顯升高(p＜0.05)，且100ng/ml、150ng/ml Nell-1蛋白處理組的ALP活性呈現(xiàn)濃度依賴性增高。選取Ne

6、ll-1蛋白的最佳起效濃度100ng/ml，分別礦化誘導(dǎo)人牙髓細胞3d、5d、7d，發(fā)現(xiàn)隨著礦化時間的延長，ALP活性逐漸增高;且相同礦化時間點上Nell-1蛋白處理組與空白對照組相比，ALP活性顯著增高(p＜0.05)。
　　3、用100ng/ml的Nell-1蛋白處理人牙髓細胞，Real-time PCR結(jié)果顯示在同一誘導(dǎo)時間點上，OPN、DMP-1的mRNA相對表達量均比空白對照組增高，礦化誘導(dǎo)12h、24h時，OPN、DM

7、P-1 mRNA相對表達量與對照組相比顯著增高，而OCN、Runx2在各時間點的mRNA相對表達量無明顯差異(p＞0.05)。在蛋白表達水平上，刺激后6h時，對照組與實驗組的OPN和DMP-1表達量無明顯差異;在12h時，實驗組OPN和DMP-1明顯高于對照組;在刺激24h時，兩組蛋白表達量差異更加明顯(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、經(jīng)改良酶消化法體外培養(yǎng)的牙髓細胞細胞形態(tài)較一致，原代細胞形態(tài)較復(fù)雜，傳代至第三代，細