1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重影響婦女的身心健康甚至危及生命,且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升及年輕化的趨勢。目前乳腺癌的發(fā)生機制尚未完全闡明,國內(nèi)外多項研究認為乳腺癌是一種腫瘤干細胞疾病。乳腺癌干細胞(BCSCs)可能是乳腺癌發(fā)生及治療后復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的根源。因此,徹底去除乳腺癌干細胞有可能徹底治愈乳腺癌,但是,乳腺癌干細胞只占乳腺癌的極少一部分,目前的關(guān)鍵是尋找高效分離和鑒定乳腺癌干細胞的方法。
　　 越來越多的證據(jù)支持腫瘤干

2、細胞假說,目前的腫瘤干細胞假說認為:腫瘤是由具有自我更新,多系分化,腫瘤形成能力等特性的腫瘤干細胞驅(qū)動的。腫瘤干細胞可以自我更新,但其缺乏處穩(wěn)能力,可以無限制生長；可以多系分化,但缺乏分化成熟的能力。乳腺癌干細胞的不對稱分裂使其每分裂一次產(chǎn)生一個與自己相同的干細胞和一個具有朝向某個方向分化和分裂增生能力的祖細胞,由于兩者在實踐中難以區(qū)分,統(tǒng)稱為乳腺癌干細胞樣細胞(SLC)。CD44+／CD24-作為乳腺癌干細胞樣細胞的標志之一逐漸獲得公

3、認。CD44+／CD24-／ESA+細胞表現(xiàn)出明顯的腫瘤干細胞的特征,如可在體外自我更新、并能重新形成其親代細胞系、細胞周期更慢、分裂緩慢、少數(shù)細胞致瘤及對化療抵抗。在腔細胞系如MCF7中,ESA+接近100％,因此,分選CD44+CD24-表型的細胞可富集腫瘤干細胞。
　　 腫瘤干細胞樣細胞的數(shù)量并非恒定,而是在極大的范圍內(nèi)波動。這種數(shù)量波動可以被認為是普通細胞與干細胞樣細胞之間相互轉(zhuǎn)化的證據(jù)之一。腫瘤微環(huán)境的改變可以引起腫瘤

4、干細胞的選擇性擴增,其具體機制目前尚不明確,微環(huán)境中不同因素的改變所引起的腫瘤干細胞亞群是否相同也尚不清楚。大量研究表明放療、化療、無血清、缺氧和酸性條件等微環(huán)境因子的改變能引起腫瘤干細胞樣表型的變化或數(shù)量的增加?；煏?dǎo)致腫瘤組織的急性損傷,微環(huán)境內(nèi)的促生長信號可能會明顯的增加,用以促進腫瘤組織的再生,隨之引起腫瘤干細胞池的明顯擴大。研究表明體外化療后乳腺癌細胞群中干細胞比例較化療前明顯升高。但目前化療是否會引起乳腺癌干細胞樣細胞特性

5、的變化尚未見文獻報道。
　　 為了初步檢驗5Fu對MCF7細胞中干細胞樣細胞的影響,首先檢測了未分選的MCF7細胞系中的干細胞樣標記(Oct4、Bmi—1、Sox2)在5Fu作用下表達的變化,然后分選MCF7細胞系中的干細胞樣細胞(CD44+／CD24-細胞),分別檢測在5Fu作用下干細胞樣細胞群和非干細胞樣細胞群中干細胞樣細胞的變化情況,但是因為分選的細胞數(shù)量不足以提取RNA和細胞爬片,因此只應(yīng)用流式細胞儀檢測了分選后細胞中C

6、D44+／CD24.細胞的比例。
　　 材料和方法:
　　 1、MCF-7細胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5％CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),根據(jù)細胞的生長情況換液、傳代和凍存。
　　 2、0.1μg／ml5Fu處理MCF7。RT-PCR法分別檢測人乳腺癌細胞系MCF-7中處理前G0及處理后6代細胞G1-G6中Oct4、Bmi-1和Sox2 mRNA的表達情況。
　　 3

7、、免疫細胞化學檢測處理前G0及處理后G1-G5中Oct4的表達。
　　 4、流式細胞儀分選CD44+CD24-細胞。細胞分組:經(jīng)過FITC-CD44／PE-CD24抗體標記,將MCF7細胞分成兩群:CD44+CD24-細胞群,即干細胞樣細胞群,另一群為非干細胞樣細胞群。分選的細胞接種到六孔板中繼續(xù)培養(yǎng),每組三個復(fù)孔。①干細胞樣細胞群常規(guī)培養(yǎng)組；②干細胞樣細胞5FU(0.1μg／ml)組；③非干細胞樣細胞群常規(guī)培養(yǎng)組；④非干細胞樣

8、細胞5FU(0.1μg／ml)組。
　　 5、流式細胞儀檢測各組細胞在不同培養(yǎng)時間(0h、24h、48h、72h、144h、168h)的CD44+CD24-細胞的比例。
　　 6、統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學處理。統(tǒng)計數(shù)據(jù)中,計量資料用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析和配對資料t檢驗(t-test)進行統(tǒng)計學檢驗。檢驗水準為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、RT-P

9、CR的結(jié)果:5Fu處理后第三代G3和第五代G5中Oct4mRNA的表達較處理前G0代明顯增高,G1、G2、G4、G6代中較處理前降低,差異均有統(tǒng)計學意義。Bmi-1mRNA在處理后第三代G3和第五代G5中的表達較處理前G0代的表達明顯增高,G1、G4、G6代中Bmi-1的表達較處理前降低,差異有統(tǒng)計學意義,而第二代G2中的表達與處理前G0代的表達差異無統(tǒng)計學意義。Sox2mRNA在處理后第三代G3和第五代G5中的表達較處理前G0代的表達

10、明顯增高,G2、G4、G6代中Sox2的表達較處理前降低,差異有統(tǒng)計學意義,而第一代G1中的表達與處理前G0代的表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　 2、免疫細胞化學結(jié)果:在MCF7細胞系中,Oct4主要在細胞核表達,細胞漿也有表達。Oct4在G1-G5代中蛋白的表達與處理前G0代的表達差異均有統(tǒng)計學意義,與G0代相比,Oct4的表達表現(xiàn)出降低-升高-更高-降低-升高的趨勢。
　　 3、MCF7細胞系中CD44+CD24-細胞的

11、比例為24.75％±1.20,但為了進一步保證CD44+CD24-細胞的分選純度,實際分選的MCF7細胞系中CD44+CD24-細胞的比例為15.35％±0.35。干細胞群組(CD44+CD24-細胞組)體積較小,倒置顯微鏡下也見干細胞群組細胞體積更小,更接近圓形。
　　 4、干細胞群組中,常規(guī)培養(yǎng)對照組細胞在0h、24h、48h、72h、144h、168h時CD44+／CD24-細胞的比例(％)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。經(jīng)5FU處理

12、后,CD44+／CD24-細胞的比例增高。5FU組與常規(guī)培養(yǎng)對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義。非干細胞群組中,常規(guī)培養(yǎng)對照組細胞在0h、24h、48h、72h、144h、168h時CD44+／CD24.細胞的比例(％)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。經(jīng)5FU處理后,CD44+／CD24-細胞的比例增高。5FU組與常規(guī)培養(yǎng)對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、MCF7細胞中Oct4、Bmi-1、Sox2的mRNA及Oct