1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種侵犯皮膚及多器官、臨床表現(xiàn)復雜、病程遷延反復的自身免疫性疾病,對患者的身心健康造成較大危害,已經成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。近年來,SLE病因學研究發(fā)展迅速,在免疫、遺傳、流行病學等領域均取得了一定進展。已有研究表明,輔助性T細胞(Helper T Cell,Th)在SLE及其它自身免疫疾病的發(fā)病中起重要作用,活化的自身反應性T

2、h細胞促使B細胞分化、產生自身抗體,包含自身抗體的免疫復合物和炎性Th細胞因子導致組織和器官損傷。
　　低氧誘導因子-1(Hypoxia-Inducible Factor1,HIF-1)是一種異二聚體轉錄因子,1992年由美國Semenza等人首先發(fā)現(xiàn),它由亞單位HIF-1α和HIF-1β組成。HIF-1α廣泛表達于各種組織,既是 HIF-1的調節(jié)亞基又是活性亞基,因此 HIF-1的生物效應是由α亞基實現(xiàn)的。表達于T細胞中的HIF

3、-1α,在低氧或非低氧的刺激下,均可以促進其 mRNA表達的增加。已有證據顯示,在炎癥反應過程中,機體常需要“激活”HIF-1,以應對炎癥過程中的低氧,而HIF-1本身也可通過調節(jié)免疫細胞而驅動炎癥反應。在癌癥、炎性腸炎和感染等炎癥性疾病的免疫反應調節(jié)過程中,HIF-1均扮演了至關重要的角色。
　　近年來本課題組和國內外的研究均發(fā)現(xiàn),Th17細胞及其相關細胞因子參與了SLE的發(fā)病。與Th17細胞介導的炎癥反應相對應,調節(jié)性T細胞(

4、Regulatory T Cells,Tregs)則在維持外周耐受,壓制自身反應性T細胞活性等免疫調節(jié)過程中扮演了至關重要的角色。在正常情況下Treg細胞和Thl7細胞的效應處于一種平衡狀態(tài),Treg/Thl7平衡失調在組織炎癥和自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。同時,SLE患者體內的調節(jié)性 T細胞也存在著功能和數(shù)量上的異常?；罨腡h17和缺陷的Tregs在SLE發(fā)病過程中起著重要作用。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α

5、能激活RORγt(Retinoid-related Orphan Nuclear Receptorγt,維甲酸相關孤核受體γt)的轉錄,從而促進Th17的增殖,并且可與RORγt、p300共同作用上調IL-17A基因表達;同時,HIF-1α通過介導轉錄因子Foxp3(foxhead box protein3,叉頭樣轉錄因子P3)降解而抑制Treg細胞的發(fā)育。這些研究提示Th17/Tregs分化平衡依賴于HIF-1α;阻斷HIF-1α有可

6、能減緩Th17細胞介導的自身免疫性疾病。
　　表達/功能異常的HIF-1α是否可通過影響Th17/Tregs的平衡,導致炎性細胞因子的表達紊亂從而參與SLE的發(fā)病等問題尚有待于進一步探討。在中國漢族人群尚無HIF-1α與SLE的關聯(lián)研究。
　　因此,本研究擬開展HIF-1α與 SLE發(fā)病相關性的分子流行病學研究擬收集SLE患者和健康對照樣本,應用RNA干擾技術沉默HIF-1基因,檢測HIF-1基因Knockdown對SLE患

7、者體內PBMC中細胞因子表達的調節(jié)作用,初步探討HIF-1基因功能;采用ELISA等技術,檢測SLE患者與對照血清中HIF-1α表達水平的差異,并分析其與SLE疾病活動度、臨床亞型的關聯(lián);通過Sequenom MassARRAY方法,分析HIF-1α基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的關系,并進行獨立驗證。本研究分為三個部分。
　　第一部分：RNA干擾體外沉默SLE患者PBMC中HIF-1的影響及相關機制研究
　　目的：利用RNA

8、干擾技術,構建HIF-1α-shRNA慢病毒載體,沉默SLE患者外周血單個核細胞(PBMC)中HIF-1基因表達,觀察沉默效率并研究沉默后相關細胞因子表達水平變化,初步探索系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者HIF-1的基因功能。
　　方法：收集SLE確診且新發(fā)病例5例,患者符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE分類標準。采集研究對象外周血各40ml,分離 PBMC。利用 RNA干擾沉默 HIF-1基因初步研究其基因功能,并分析 HIF-lα與

9、IL-17之間的相關性。采用脂質體轉染法將LV-shRNA-HIF和LV-shRNA-HIF-NC同包裝質粒和包膜質粒共轉染到293T細胞中,獲得重組慢病毒。采用慢病毒載體方法將LV-shRNA-HIF慢病毒感染SLE患者PBMC細胞,采用實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR,RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測構建成功的RNAi表達載體在mRNA及蛋白水平對目標基因表達的抑制,同時酶聯(lián)免疫吸附試驗(

10、ELISA)法檢測 HIF-1α和IL-17在培養(yǎng)上清中的表達水平。
　　結果：(1)實驗組HIF-1沉默效率可達95％;(2)RT-PCR可見,實驗組HIF-1基因mRNA表達豐度顯著低于對照組(p<0.05);(3)Western blot可見,實驗組HIF-1蛋白表達水平顯著降低(p<0.05);(3)實驗組培養(yǎng)上清中HIF-1α濃度顯著低于對照組(p<0.001);(4)實驗組培養(yǎng)上清中IL-17濃度顯著低于對照組(p<0

11、.001);(5)實驗組HIF-1α與IL-17顯著正相關(r=0.959,p<0.001)。
　　結論：構建成功的RNAi表達載體可以有效抑制目標基因HIF-1在mRNA及蛋白水平的表達,沉默HIF-1基因后HIF-1α與IL-17表達水平顯著正相關。
　　第二部分：HIF-1α血清學表達水平與SLE的相關性研究
　　目的：比較SLE患者與正常對照、類風濕性關節(jié)炎(RA)、原發(fā)性干燥綜合癥(pSS)和系統(tǒng)性硬化癥(S

12、Sc)之間;狼瘡腎炎(LN)患者和SLE未并發(fā)腎炎患者之間;SLE患者有無某臨床癥狀之間以及活動期 SLE患者和非活動期 SLE患者之間HIF-1α血清學水平的差異,探討HIF-1α水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度、IL-17水平的關聯(lián)。
　　方法：收集149例確診的SLE患者,102例健康對照者,疾病對照組由三種常見自身免疫疾病患者組成:46例RA患者;50例pSS患者和26例SSc患者。在獲取研究對象知情同意后采用自行設計的問卷

13、進行調查,同時抽取5ml非抗凝外周靜脈血,分離血清,-80℃凍存留待檢測。采用 ELISA試劑盒檢測血清 HIF-1α和IL-17水平。數(shù)據錄入采用Excel2007軟件進行,統(tǒng)計分析采用SPSS10.01軟件進行。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間比較符合正態(tài)分布且方差齊性者采用t檢驗,兩組間定量資料相關性分析采用 Pearson相關分析。檢驗水準α=0.05。
　　結果：(1)各組人口學資料分析149例S

14、LE患者被納入分析,其中141例女性,8例男性,年齡分布從9歲到65歲(32.5±10.9)?；颊邚某霈F(xiàn)癥狀到被納入分析的時間(即采集血液并收集信息的時間)被定義為病程,從0到19.3年(3.7±4.2)。SLE患者的疾病活動度評分從1到44(12.0±7.9),81例患者為活動期病人,約占54.4%。(2)各組HIF-1α水平比較 SLE患者血清HIF-1α水平為32.76±12.60 pg/ml,健康對照組為23.04±11.35

15、pg/ml,RA患者組為28.71±10.88 pg/ml,pSS患者組為30.08±23.57 pg/ml,SSc患者組為26.15±13.92 pg/ml。兩兩比較分析發(fā)現(xiàn),SLE組與健康對照組、SSc患者組有統(tǒng)計學差異(p值分別為:p<0.0001和p=003);SLE組與RA患者組和pSS患者組無統(tǒng)計學差異(p值分別為:p=0.09和p=0.25)。同時,RA患者組和pSS患者組分別與健康對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.

16、02和p=0.004)。在SLE亞組分析中,SLE合并腎炎組血清HIF-1α水平為35.06±11.64 pg/ml,非腎炎組為32.03±12.86pg/ml,兩者之間無統(tǒng)計學差異(p=0.50),但是分別與健康對照組相比差異都具有統(tǒng)計學意義(p值均<0.0001)。SLE活動期患者血清HIF-1α水平為34.83±13.94 pg/ml,非活動期患者組為30.31±10.38 pg/ml,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.03)。對各臨床

17、癥狀陽性組與陰性組的血清HIF-1α水平進行分析,均沒有統(tǒng)計學意義(p值均>0.05)。(3)相關性分析 HIF-1α水平與 SLE疾病活動度評分(SLEDAI)顯著正相關(r=0.23;p=0.004)。同時,在SLE患者組,HIF-1α水平與IL-17水平正相關(r=0.53;p<0.0001),但是未發(fā)現(xiàn)其與SLE的病程之間的相關性(r=-0.02;p>0.05)。
　　結論：本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者與健康對照組(HC組)、SS

18、c患者組,狼瘡腎炎、非狼瘡腎炎患者與健康對照組(HC組),SLE患者疾病活動組與非疾病活動組之間HIF-1α表達水平有統(tǒng)計學差異,SLE患者與RA、PSS患者,狼瘡腎炎組與非狼瘡腎炎組之間未發(fā)現(xiàn)表達差異,SLE患者HIF-1α表達水平與SLEDAI、IL17水平存在相關,但未發(fā)現(xiàn)HIF-1α水平與 SLE患者的部分臨床特征之間存在關聯(lián)。
　　第三部分HIF-1基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性的相關性研究
　　目的：比較 SLE患

19、者和正常對照 HIF-1基因(rs11549465、rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164)的基因型頻率和等位基因頻率,探討其與中國漢族人群SLE易感性的關系,同時結合臨床資料分析其與SLE主要臨床特征之間的關系。
　　方法：病例組共1497例SLE患者,來自兩所三甲醫(yī)院的住院和門診病例,均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE分類標準;健康對照2296例,來自健康體檢中心和健康獻血者,

20、均排除SLE和其他自身免疫疾病。收集研究對象的一般情況和病例的相關臨床資料,采集所有研究對象的外周靜脈血,提取DNA凍存。利用Sequenom MassARRAY技術,檢測五個位點的多態(tài)性;比較 SLE病例組和對照組中各多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率分布是否存在差異。采用SPSS10.01軟件進行統(tǒng)計分析,以α=0.05作為檢驗水準。
　　結果：(1)哈德-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE

21、)檢驗:5個位點rs11549465、 rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164的基因型分布在對照組中均達到遺傳平衡。(2)HIF-1基因分型:五個位點的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。(3)基因分型與主要臨床特征的關系:分析 rs11549465,rs12434438,rs1957757,rs1951795和rs7143164多態(tài)性與SLE主要臨床