1、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是ErbB家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是一種重要的跨膜受體。該家族成員還包括HER2/erbB2,HER3/erbB3,HER4/erbB4。表皮生長因子受體由胞外段，跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶活性區(qū)構(gòu)成。其胞外區(qū)的主要功能是結(jié)合表皮生長因子EGF等配體激活受體胞內(nèi)段酪氨酸激酶活性，啟動信號傳導通路，在正常組織及腫瘤組織中起到調(diào)節(jié)細胞增殖、分化的作

2、用。EGFR在腫瘤進展過程中發(fā)揮了重要的作用，它能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移、抑制凋亡以及促進腫瘤組織的血管生成等。臨床研究顯示，腫瘤的惡化、患者的低生存率以及對藥物的低敏感性與腫瘤細胞胞表達EGFR分子成正相關(guān)。近年來，隨著癌癥檢測手段的發(fā)展，在很多癌癥包括前列腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等患者中檢測到了EGFR的異常高水平的表達。因此，EGFR成為腫瘤靶向研究的熱點。兩個研究比較成功的例子是單克隆抗體和小分子酪氨酸抑制劑(TKI

3、)。其中單克隆抗體方面的Cetuximab、panitumumab,TKI方面的Tarceva(Erlotinib)、Iressa(Gefitinib)等已經(jīng)被FDA批準用于臨床的癌癥治療。這兩方面的成功提示我們，靶向EGFR的治療策略是可行的，并將在癌癥治療領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。 在本研究中，我們試圖通過對小鼠免疫異種EGFR蛋白，使小鼠產(chǎn)生抗EGFR的抗體，來阻斷EGFR信號通路，從而達到抗腫瘤效果。根據(jù)GenBank發(fā)表的雞源

4、EGFR基因序列，我們設(shè)計了一對特異性核苷酸引物，用PCR方法獲得雞源EGFR胞外部分642bp大小的基因片段，并將其克隆到表達載體pGEX-4T-2上，測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定篩選出陽性克隆，IPTG誘導，并進一步通過Ni-NTA Agarose親合層析純化目的蛋白，純化產(chǎn)物以SDS-PAGE鑒定。純化產(chǎn)物經(jīng)透析復(fù)性，Western blot鑒定其抗原性，得到用于免疫的GST-eEGF

5、R融合蛋白。將14只C57BL16J小鼠隨機分為2組，GST-cEGFR實驗組7只、生理鹽水對照組(NS)7只，實驗組和對照小鼠每只分別于第0，2，3周注射100μgGST-cEGFR融合蛋白和100μL生理鹽水。接種Lewis肺癌細胞，觀察腫瘤的生長情況和小鼠狀態(tài)并檢測小鼠血清中特異性抗EGFR抗體滴度。 實驗中成功克隆了包含642bp的雞源EGFR基因，構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒pGEX4T2-cEGFR。cEGFR-GST融合

6、蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達，經(jīng)Ni-NTA Agarose純化后得到純度達85％以上的重組融合蛋白。經(jīng)復(fù)性，融合蛋白以可溶的形式存在，Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原性。動物實驗結(jié)果表明，GST-cEGFR疫苗組小鼠血清的抗EGFR抗體滴度為1:5000，并對小鼠腫瘤生長有一定的抑制效應(yīng)。本研究表明，通過基因工程方法制備出的異種重組EGFR蛋白，可在小鼠體內(nèi)誘導出抗EGFR抗體，成功的打破了小鼠的免疫耐受，有一定的抗腫