海產(chǎn)品中副溶血性弧菌快速檢測(cè)研究及應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  建立一種特異、靈敏的快速檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌及其毒力基因的方法,并用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速檢測(cè)。
  方法:
  1.直接分離檢測(cè)法:制備副溶血性弧菌ATCC338471×100~1×106cfu/ml菌液,取各濃度菌液1ml直接用TCBS平板進(jìn)行劃線分離,每一濃度平行三份。對(duì)疑似菌落純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定和毒力試驗(yàn)。記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
  2.國(guó)標(biāo)(GBT4789.7-2008)檢測(cè)法:制備副溶

2、血性弧菌ATCC338471×100~1×107cfu/ml濃度菌液,37℃增菌8h后,取各濃度增菌液1ml用TCBS平板進(jìn)行劃線分離,平行三份。對(duì)疑似菌落純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定和毒力實(shí)驗(yàn)。記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
  3.直接PCR檢測(cè)法:制備副溶血性弧菌ATCC338471×100~1×106cfu/ml濃度菌液,取1ml菌液,提取基因組DNA,用特異性引物進(jìn)行PCR,檢測(cè)副溶血性弧菌種特異性基因tlh和毒力基因tdh。記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3、r>  4.快速檢測(cè)法:振蕩培養(yǎng)增菌結(jié)合PCR法。取副溶血性弧菌ATCC338471×100~1×106cfu/ml菌液1ml,加入到200ml堿性蛋白胨水中,37℃150rpm振蕩培養(yǎng)3h。分別取1ml增菌液提取細(xì)菌基因組DNA,PCR檢測(cè)種特異性基因tlh和毒力基因trh、tdh。
  5.快速檢測(cè)法檢測(cè)模擬樣本中副溶血性弧菌:制備副溶血性弧菌ATCC33847污染牡蠣的模擬樣本,形成2.5×105、2.5×104、2.5×1

4、03、2.5×102、2.5×101、2.5×100、2.5×10-1cfu/ml濃度梯度帶菌量,37℃150rpm振蕩培養(yǎng)3h后,取1ml菌液,提取基因組DNA,用特異性引物進(jìn)行PCR,檢測(cè)副溶血性弧菌種特異性基因tlh和毒力基因tdh。記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
  6.快速檢測(cè)法檢測(cè)市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌:購(gòu)買(mǎi)溫州市售海產(chǎn)品160份,用快速檢測(cè)法檢測(cè)副溶血性弧菌。同時(shí)用國(guó)標(biāo)法、直接PCR法檢測(cè)。
  結(jié)果:
  1.直接分

5、離檢測(cè)法:檢測(cè)副溶血性弧菌ATCC33847,檢測(cè)下限為1×104cfu/ml。實(shí)驗(yàn)需24h,生化鑒定及毒力實(shí)驗(yàn)需48h。
  2.國(guó)標(biāo)法(GBT4789.7-2008):檢測(cè)副溶血性弧菌ATCC33847,檢測(cè)下限為1×103cfu/ml。實(shí)驗(yàn)需36h,生化鑒定及毒力實(shí)驗(yàn)需48h。
  3.直接PCR法:檢測(cè)副溶血性弧菌ATCC33847 tlh和tdh基因,檢測(cè)下限為1×102cfu/ml。實(shí)驗(yàn)需3~4h。
  4

6、.快速檢測(cè)法:檢測(cè)副溶血性弧菌33847 tlh和tdh基因,檢測(cè)下限為1×100cfu/ml。實(shí)驗(yàn)需8h。
  5.快速檢測(cè)法檢測(cè)模擬樣本:檢測(cè)下限為2.5×100cfu/ml。實(shí)驗(yàn)需8h。
  6.快速檢測(cè)法檢測(cè)市售海產(chǎn)品中VP:快速檢測(cè)法檢測(cè)溫州市售160份海產(chǎn)品,檢出VP陽(yáng)性110份,檢出率68.8%;110份標(biāo)本檢出攜帶VP毒力基因35份(31.8%),其中trh+23份,tdh+12份。國(guó)標(biāo)法VP檢出率40.0%

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