1、分類號：學(xué)校代碼：10426密級：學(xué)號：2013050066碩士學(xué)位論文MASTERDEGREETHESISDNA等溫?cái)U(kuò)增檢測副溶血性弧菌的新技術(shù)研究作者：潘美潘美指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師：馬翠萍馬翠萍學(xué)科專業(yè)學(xué)科專業(yè)：海洋化學(xué)海洋化學(xué)專業(yè)代碼專業(yè)代碼：070702研究方向研究方向：生物分析化學(xué)生物分析化學(xué)2016年6月3日青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文IDNA等溫?cái)U(kuò)增檢測副溶血性弧菌的新技術(shù)研究摘要近年來，新發(fā)展起來的核酸擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命

2、科學(xué)及其相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域，對生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮著重要的作用。由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要反復(fù)的熱變性，依賴于特定的熱循環(huán)儀，從而使其應(yīng)用范圍受到了一定的限制。因此，建立簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)對核酸的體外擴(kuò)增檢測具有非常重要的意義，并在臨床和現(xiàn)場快速診斷中具有良好的應(yīng)用前景。本論文構(gòu)建了兩種簡單、快速、靈敏檢測DNA的等溫核酸擴(kuò)增新方法。在第二章中，本論文基于鄰近效應(yīng)原理在等溫條件下構(gòu)建了DNA檢測的新方法。首先，設(shè)計(jì)了兩種實(shí)驗(yàn)方

3、案，并對方案進(jìn)行了優(yōu)化。以副溶血性弧菌的特征序列為檢測靶標(biāo)，對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，并對引物的長度和濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下對不同濃度的靶標(biāo)DNA進(jìn)行檢測，最低可以檢測到0.1fmol，且靶標(biāo)含量在100fmol0.1fmol的范圍內(nèi)，熒光信號的POI值與靶標(biāo)濃度呈良好的線性關(guān)系。該檢測方法操作簡單，反應(yīng)迅速、對儀器的依賴性低。在第三章中，本論文構(gòu)建了一種基于熒光探針檢測雙鏈DNA的新方法。該方法首先借助切刻內(nèi)切酶與聚合酶的聯(lián)

4、合作用，在靶標(biāo)雙鏈DNA上引發(fā)線性鏈置換擴(kuò)增，將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為單鏈。然后利用設(shè)計(jì)的雙鏈熒光探針作為引物在單鏈DNA上引發(fā)后續(xù)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。該方法以大腸桿菌pBlueIIKS()（PBS）質(zhì)粒作為檢測對象，最低可以檢測到2.3amol的PBS質(zhì)粒；且該方法具有較強(qiáng)的特異性，即使雙鏈熒光探針中只含有一個(gè)堿基錯(cuò)配也能將其有效的區(qū)分；為了檢驗(yàn)該方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用，在復(fù)雜體系下對靶標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法具有較強(qiáng)的抗干擾能