1、DAHC1基因位于13號染色體長臂的21帶上，該基因作為新發(fā)現的抑癌基因，其表達的蛋白作為轉錄因子，在乳腺癌、子宮內膜癌以及前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲以及轉移的作用。臨床研究結果提示，DACH1在乳腺癌、子宮內膜癌以及前列腺癌中表達缺失或低表達。臨床統(tǒng)計學分析發(fā)現，乳腺癌以及子宮內膜癌腫瘤組織中DACH1表達水平與患者原發(fā)腫瘤大小、原發(fā)灶分期、腹膜轉移以及淋巴結轉移密切相關，同時發(fā)現DACH1表達水平與乳腺癌腫瘤組織

2、中細胞增殖狀況呈相反關系。盡管DACH1在腫瘤中的重要作用已有許多報道報道，但目前有關該基因在肺癌的作用尚未有研究報道。我們在前期研究中，通過基因芯片對5例肺腺癌和5例肺鱗癌組織與其對應癌旁組織的基因表達譜進行比較，發(fā)現肺癌組織中DACH1的mRNA表達水平較癌旁組織明顯下調，提示DACH1表達下調與肺癌發(fā)生發(fā)展可能存在相關性。因此，本研究擬通過擴大樣本量，利用熒光定量PCR以及Western-blotting方法檢測DACH1表達水平

3、，以進一步明確DACH1在肺腺癌和肺鱗癌組織表達是否存下調。在此基礎上，我們將按照用生物信息學分析結合實驗驗證的方法分析DACH1在肺癌組織中表達下調的原因。明確了DACH1表達下調的原因以后，我們將嘗試探索DACH1表達下調對肺腺癌和肺鱗癌發(fā)生發(fā)展產生影響的內在分子生物學機制。
　　 第一部分、DACH1在肺腺癌和肺鱗癌及對應正常組織中的表達
　　 目的:檢測DACH1在肺腺癌和肺鱗癌及其對應正常組織中的表達，以明確D

4、ACH1在肺癌及癌旁組織中的表達情況。
　　 方法:(1)1.抽提59例肺腺癌和46例鱗癌及其對應正常組織的總RNA;2.將RNA反轉錄成不易分解的cDNA;3.采用RT-PCR方法對DACH1的mRNA水平表達進行檢測。(2)1.利用蛋白裂解液等溶劑抽提59例肺腺癌和46例腺癌組織及其對應正常組織中的蛋白;2.采用Bradford方法，同時繪制標準曲線，以測定組織蛋白濃度;3.配制SDS-PAGE電泳液，并按實驗相應條件進行S

5、DS-PAGE電泳;4.利用PVDF膜，按轉膜條件進行轉膜;5.在不同條件下，分別加入一抗、二抗進行免疫反應;6.進行化學發(fā)光反應，根據不同的光強度調整曝光條件;7.凝膠圖像分析。
　　 結果:(1).腫瘤組織中DACH1的mRNA表達水平低于對應癌旁（正常）組織內DACH1的mRNA表達水平;(2).腫瘤組織內DACH1蛋白含量均低于對應癌旁（正常）組織內DACH1蛋白含量，統(tǒng)計學結果表明，肺癌標本內DACH1蛋白表達水平與患

6、者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結侵襲無顯著統(tǒng)計學差異，但與患者臨床分期顯著相關(P=0.008＜0.01)。
　　 結論:DACH1在肺腺癌和肺鱗癌組織中低表達，提示DACH1表達異常與肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展存在相關性。
　　 第二部分、DACH1表達下調的機制研究
　　 目的:探討調控DACH1 mRNA及蛋白表達下調的機制。
　　 方法:(1)DNA甲基化對DACH1轉錄的影響:通過生物信息學分析尋找

7、DACH1啟動子和第一內含子序列中的CpG島，采用亞硫酸鹽測序法分析肺腺癌和肺鱗癌組織與對應癌旁組織中DACH1基因的CpG島的甲基化狀態(tài);(2)miRNA對DACH1翻譯的影響:通過生物信息學分析結合miRNA芯片篩選調控DACH1表達的潛在miRNA，合成相應miRNA雙鏈模擬物或阻遏物轉染肺腺癌和鱗癌細胞株，利用RT-PCR以及Western-blotting檢測miRNA過表達或低表達對DACH1表達水平的影響;(3)miRNA

8、對DACH1表達的直接調控作用:構建DACH1基因3'UTR區(qū)熒光素酶報告基因載體，通過熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA對DACH1的直接調控作用。
　　 結果:(1).DACH1第一內含子富含CpG島，但肺腺癌組織和肺鱗癌組織與其對應癌旁組織并不存在甲基化差異;(2)生物信息學結合芯片篩選提示miRNA-302d、miRNA-429、miRNA-7是以DACH1為靶基因且在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達上調的miRNA，但miRN

9、A-302d、miRNA-429、miR-NA7過表達和低表達對肺癌細胞中DACH1的mRNA表達水平均無顯著影響(P=0.67＞0.05，P=0.78＞0.05)，而miRNA-302d過表達和低表達均顯著影響肺腺癌和肺鱗癌細胞中DACH1蛋白的表達水平(P=0.007＜0.01，P=0.009＜0.01);(3)miRNA-302d可直接結合于DACH1基因3'UTR區(qū)對DACH1蛋白的具有直接調控的作用。
　　 結論:(1

10、).DACH1基因在肺癌組織與癌旁組織中并不存在甲基化差異，提示基因甲基化并不是DACH1在肺癌組織內表達下調的原因;(2).miRNA-302d過表達或低表達均可調控肺癌細胞中DACH1蛋白的表達但對DACH1的mRNA表達無顯著影響，提示miRNA-302d過表達是抑制肺癌組織中DACH1表達的原因之一;(3).miRNA-302d結合于DACH1基因3'UTR區(qū)對DACH1蛋白的具有直接調控的作用。
　　 第三部分、miR

11、NA-302d在肺腺癌和肺鱗癌以及對應正常組織中的表達
　　 目的:檢驗臨床組織標本中59例肺腺癌和46例肺鱗癌及其對應正常組織中miRNA-302d水平，以驗證miRNA-302d在肺腺癌和肺鱗癌與其對應正常組織中的表達是否存在差異。
　　 方法:(1)1.利用組織研磨機在液氮條件下充分磨碎組織;2.利用RNA抽提試劑盒，嚴格按照操作手冊要求和方法抽提組織中RNA;3.根據實驗要求配制RNA反轉錄反應液，利用PCR儀進

12、行反轉錄獲得c-DNA，稀釋后4℃保存;4.根據實驗要求配制RT-PCR反應液，利用RT-PCR儀進行miRNA302-d擴增實驗;5.利用steponesoftware軟件分析miRN-302d擴增結果，收集實驗數據進行統(tǒng)計分析。(2).利用t檢驗等統(tǒng)計學方法分析miRNA-302d表達異常與肺癌患者臨床數據的相關性。
　　 結果:(1).miRN-302d在肺癌腺癌鱗癌內高表達。(2).miRN-302d表達與患者年齡、性別

13、、腫瘤大小、淋巴結侵襲無顯著統(tǒng)計學差異，但與患者臨床分期顯著相關(P=0.006＜0.01)。
　　 結論:miRNA-302d在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達水平顯著上升且與臨床分期相關，提示miRNA-302d可能與肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　 第四部分、miRNA-302d抑制DACH1表達促進肺腺癌和肺鱗癌細胞增殖的機制研究
　　 目的:1.明確miRNA-302d對肺腺癌和肺鱗癌細胞增殖的影響;2

14、.探討miRNA-302d通過抑制DACH1蛋白表達促進肺腺癌和肺鱗癌細胞增殖的作用機制。
　　 方法:1.合成相應miRNA雙鏈模擬物或阻遏物轉染肺腺癌和鱗癌細胞株，以觀察miRNA-302d過表達或低表達對肺癌細胞增殖能力的影響;2.利用流式細胞儀檢測miRNA-302d過表達或低表達對肺癌細胞周期的影響;3.采用MTT實驗方法觀察miRNA-302d過表達或低表達對肺癌細胞增殖活性的影響;4.采用細胞平板成克隆實驗方法，觀

15、察miRNA-302d過表達或低表達對肺癌細胞成克隆能力的影響;5.通過miRNA雙鏈模擬物與特異針對DACH1的siRNA共轉細胞，驗證miRNA-302d是否通過調控DACH1的表達影響肺腺癌和肺鱗癌的增殖。
　　 結果:1.細胞周期實驗、細胞增殖活性檢測實驗以及細胞平板成克隆能力實驗均的結果提示miRNA-302d可調控肺腺癌和肺鱗癌細胞的增殖;2.miRNA雙鏈模擬物與特異針對DACH1的siRNA共轉實驗結果則提示mi