1、研究目的:醛固酮在調節(jié)細胞外液,維持電解質平衡以及控制血壓穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要的作用,醛固酮重要的生理功能有賴于通過調控腎上皮鈉通道(ENaC)對鈉的重吸收,目前已知相關的作用機制分為基因組作用和非基因組作用。其中,研究較清楚的是醛固酮的基因組作用方式:醛固酮進入集合管主細胞后,與胞漿內的鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)結合,形成激素-受體復合體,后者進入細胞核與核中DNA特異性結合位點相互

2、作用,調節(jié)特異性mRNA轉錄,最終合成多種醛固酮誘導蛋白(aldosterone-induced protein,AIP),使管腔膜(apical side)ENaC活性增強,基側膜(basolateral side)鈉鉀泵的活性增加,從而促進跨上皮細胞的Na+重吸收。醛固酮基因組作用的特點是作用起效較慢,作用時間長,對MR阻斷劑敏感。此外,醛固酮還可發(fā)揮快速的非基因組作用來調控Na+的重吸收,此作用的特點為起效迅速,對MR阻斷劑不敏感

3、,但其內在機制還知之甚少。因此研究醛固酮非依賴MR快速調控ENaC的作用及其相關的作用機制,有助于進一步全面了解醛固酮調節(jié)ENaC作用的生理、病理意義,同時也可促進新型醛固酮拮抗藥物的研發(fā),為醛固酮快速作用提供可能的應對措施。
　　主要內容:
　　1、建立具有ENaC活性的哺乳動物腎上皮細胞模型并進行評價。
　　2、研究醛固酮快速調控ENaC的作用。
　　3、探討醛固酮快速調控ENaC的可能機制。
　　研究

4、方法:
　　1.實驗細胞模型的建立
　　建立具有ENaC活性的哺乳動物腎上皮細胞模型-選擇MDCK(Madin-Darby canine kidney)、mpkCCD(mouse principle cell of kidney in cortical collecting duct)兩種細胞株,培養(yǎng)成具有完整膜,有極性,高阻抗,阿米洛利敏感的細胞模型,最后通過觀察細胞形態(tài)結構、測量跨膜電阻值、測量細胞單通道記錄三個方面來評

5、估,擇優(yōu)選出適合進一步實驗的理想細胞模型。
　　2.醛固酮對ENaC的快速調控作用
　　給予醛固酮(10-6M/L)作用于mpkCCD細胞模型,觀察醛固酮對細胞形態(tài)結構、阿米洛利敏感的跨膜電阻、胞內鈣離子濃度、單通道離子電流的影響。使用MR阻斷劑螺內酯以及醛固酮轉錄、蛋白合成抑制劑,驗證醛固酮對ENaC快速(<3小時)調節(jié)作用主要是非依賴MR的非基因組作用。
　　3.醛固酮對ENaC作用機制的研究
　　(1)通過

6、使用PI3-K通路特異性的阻斷劑LY294002(50um/L)驗證PI3-K通路在醛固酮快速調控ENaC過程中的作用。
　　(2)通過使用鈣離子載體A23187(1um/L)快速增加胞內鈣離子濃度來探討胞內鈣離子在醛固酮調控快速調控ENaC過程中的作用。
　　(3)通過使用細胞松弛素D(CytD)打斷細胞骨架F-actin,探討細胞形態(tài)與ENaC功能活性之間的關系。
　　4.主要的指標及測量方法
　　(1)細胞

7、形態(tài)學觀察:掃描離子電導顯微鏡(SICM)
　　(2)跨膜電阻值:跨膜電阻儀(EVOM2)
　　(3)單通道離子電流:膜片鉗cell-attached單通道記錄
　　(4)胞內鈣離子:高速比率鈣離子濃度測量熒光顯微技術
　　結果:
　　1.建立了具有ENaC活性哺乳動物腎上皮細胞模型-mpkCCD細胞模型。
　　2.醛固酮作用于mpkCCD細胞,細胞發(fā)生橫向收縮縱向伸展,胞內鈣離子濃度升高,整體膜和單

8、通道水平的ENaC活性增強,表現(xiàn)為阿米洛利敏感的跨膜電阻升高和離子通道開放概率增加。
　　3.LY294002能夠阻斷醛固酮對ENaC的激活作用,表現(xiàn)為細胞恢復原貌,阿米洛利敏感的跨膜電阻降低和離子通道開放概率減少。
　　4.A23187能迅速增加胞內鈣離子濃度,并增強ENaC活性,表現(xiàn)在阿米洛利敏感的跨膜電阻升高和離子通道開放概率增加。
　　5.CytD能使細胞發(fā)生橫向收縮縱向伸展的形變,ENaC活性增強,表現(xiàn)為阿米