1、小型化、高效化是靶向抗腫瘤藥物的發(fā)展趨勢(shì)，與抗體及其片段相比，靶向肽具有分子量更小、免疫原性更弱的優(yōu)點(diǎn)。本文的第一部分，通過基因工程的方法制備CD13靶向肽NGR(Asn-Gly-Arg)與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白，再通過分子強(qiáng)化技術(shù)組裝發(fā)色團(tuán)，得到有活性的強(qiáng)化融合蛋白，并對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。第二部分，通過化學(xué)方法合成抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)與云南霉素(yaannanycin，YNM)的偶聯(lián)物，并研究其抗腫瘤

2、活性。 1．CD13靶向肽與力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白的制備及抗腫瘤活性NGR-CD13是良好的腫瘤新生血管靶向系統(tǒng)，NGR序列與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD13異構(gòu)體特異結(jié)合。力達(dá)霉素(lidamycin，LDM，又叫C1027)是大分子肽類抗腫瘤抗生素，由輔基蛋白(lidaprotein，LDP)和活性烯二炔發(fā)色團(tuán)(active enediyne，AE)構(gòu)成，發(fā)色團(tuán)具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用但不穩(wěn)定，輔基蛋白對(duì)發(fā)色團(tuán)起保護(hù)作用。LDP和A

3、E以非共價(jià)鍵結(jié)合，可以拆分和重建，重建后的蛋白具有同樣的細(xì)胞毒作用，這為體外LDP融合蛋白與AE的分子重建提供了基礎(chǔ)。本研究先通過基因工程的方法制備NGR肽與LDP的融合蛋白，再通過分子強(qiáng)化組裝發(fā)色團(tuán)，得到有活性的強(qiáng)化融合蛋白，并對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠皮下移植性肝癌H22模型，分別于接種后3天和10天尾靜脈注射給藥兩次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：強(qiáng)化融合蛋白對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，實(shí)驗(yàn)第16天0.2 mg

4、/kg、0.4 mg/kg和0.8 mg/kg三個(gè)劑量組的NGR-LDP-AE抑瘤率分別為59.8％、77.8％和94.8％，0.05 mg/kg的游離力達(dá)霉素(耐受劑量)抑瘤率為66.9％，未經(jīng)強(qiáng)化的融合蛋白NGR-LDP基本無抑瘤作用。治療期間動(dòng)物體重沒有減輕，沒有觀察到其它明顯的毒副作用，表明所用劑量為可耐受劑量。 2.云南霉素與抗黏附肽RGD偶聯(lián)物的合成及其抗腫瘤活性抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)的受體是細(xì)胞表

5、面的整合素(integrin)，通過制備RGD與云南霉素的偶聯(lián)物，使終產(chǎn)物既具備RGD肽抗黏附的功能，又具有云南霉素殺傷細(xì)胞的能力。 云南霉素的羥基、氨基用叔丁氧甲?；?Boc)保護(hù)，RGD的羧基用甲酯基(0pMe)保護(hù)；以2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)為縮合劑，使云南霉素的羧基與RGD的氨基縮合得到偶聯(lián)物；薄層層析(TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。利用硅膠制備板對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)終產(chǎn)物終含有分子量

6、分別為773 Da、801 Da和901 Da的成份，分別對(duì)應(yīng)于YNM-RGD、YNM-RGD(OMe)<,2>和YNM(Boc)-RGD(OMe)<,2>；HPLC分析三種化合物的總含量為87.16％。MTT顯示偶聯(lián)物和云南霉素對(duì)PG細(xì)胞的.IC<,50>值分別為0.129 mM和0.01 mM，對(duì)Bel-7402細(xì)胞的IC<,50>值為0.135 mM和0.029mM，0.1 mM的RGD對(duì)兩種細(xì)胞均無明顯的細(xì)胞毒作用；1 mM時(shí)偶

7、聯(lián)物、云南霉素和RGD對(duì)PG細(xì)胞的抑制率分別為73.1％、91.8％和16.9％。Boyden chamber顯示0.1 mM時(shí)偶聯(lián)物和RGD對(duì)PG細(xì)胞跨膜的抑制率分別為50.9％和40.8％；0.2 mM時(shí)為66.4％和56.2％；0.4mM時(shí)為66.6％和57.1％；0.1 mM的云南霉素對(duì)PG的細(xì)胞跨膜能力無明顯影響。偶聯(lián)物兼有云南霉素和RGD的生物活性；與云南霉素相比，偶聯(lián)物的細(xì)胞毒作用下降，但與RGD相比仍有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用；