1、背景與目的:
　　前列腺癌是常見的男性惡性腫瘤之一,晚期前列腺癌經(jīng)抗雄激素治療6~18個月后,80％進展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC),至今還沒有能治愈AIPC的療法。目前針對AIPC治療的實驗研究也進展緩慢,尚無明顯突破。因此,探索新的治療方法以走出目前AIPC治療的困境是非常有必要的。
　　基于溶瘤腺病毒的病毒-基因治療成為腫瘤治療研究熱點,為AIPC的治療提供了一種可行的方法。我們在前期實驗中以rPB為基礎(chǔ)構(gòu)建了

2、rPB-DR(6)啟動子,該啟動子保持了前列腺組織特異性,同時可以對維甲酸-維甲酸受體復(fù)合物起反應(yīng)。由于所有的前列腺癌均表達維甲酸受體,在維甲酸存在時,rPB-DR(6)啟動子可特異性地在所有類型的前列腺癌細胞(包括AIPC)中起作用,驅(qū)動下游基因表達,故該啟動子可用于構(gòu)建針對AIPC的溶瘤腺病毒。因此本研究擬制備rPB-DR(6)調(diào)控的溶瘤腺病毒,同時使其攜載自殺基因胞嘧啶脫氨酶(CD)進一步增強抗腫瘤作用,觀測其對包括AIPC在內(nèi)的

3、前列腺癌細胞的殺傷作用。
　　方法:
　　以pUC119-rPB-DR(6)和pCD2為模板,PCR法擴增出rPB-DR(6)啟動子和CD基因,將rPB-DR(6)啟動子插入到腺病毒早期基因E1A之前,同時插入mCMV啟動子驅(qū)動的CD基因,構(gòu)建出重組質(zhì)粒p55-rPB-DR(6)-mCMV-CD(簡寫為p55-rPC),鑒定后將質(zhì)粒p55-rPC與腺病毒骨架質(zhì)粒pPE3共轉(zhuǎn)染293細胞并包裝出重組溶瘤腺病毒Ad5-rPB-D

4、R(6)-mCMV-CD,簡稱Ad5-rPC,擴增、純化并測定滴度。采用Ad5-rPC感染雄激素依賴和非依賴性前列腺癌細胞,Western Blot檢測病毒早期基因E1A和自殺基因CD蛋白表達水平,TCID50法檢測重組腺病毒Ad5-rPC感染癌細胞細后的復(fù)制能力,并應(yīng)用CCK-8法檢測重組病毒Ad5-rPC對前列腺癌細胞的特異性殺傷能力。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定證實成功構(gòu)建了包含rPB-DR(6)啟動子和

5、CD基因的重組溶瘤腺病毒Ad5-rPC,制備的重組溶瘤腺病毒Ad5-rPC滴度為1.1×1011pfu/mL。Ad5-rPC病毒感染前列腺癌細胞,Western Blot法檢測到E1A和CD蛋白陽性表達。Ad5-rPC感染前列腺癌細胞系產(chǎn)生的子代病毒滴度均大于3.0×106pfu/mL,CCK-8法證實重組腺病毒對雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細胞均具有特異性殺傷能力,殺傷能力均大于65%。
　　結(jié)論:
　　(1)成功制備了