1、第一部分:攜帶livinα基因的腺病毒感染DC制作腫瘤疫苗
　　[實(shí)驗(yàn)背景]
　　凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族成員能夠通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域(baculovirusIAPrepeatsdomain,BIR)與促凋亡的半胱天冬酶(Caspase)結(jié)合,從而細(xì)胞抑制凋亡。Livin基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的IAP家族成員,它有兩種剪接異構(gòu)體分別為L(zhǎng)ivinα和Livinβ。Livi

2、n在正常成人組織中含量甚微或不表達(dá),而普遍過(guò)表達(dá)于原發(fā)性肺癌和其他惡性腫瘤組。腫瘤患者血清中存在Livin蛋白抗體,顯示人的免疫系統(tǒng)對(duì)Livin蛋白無(wú)免疫耐受。腺病毒載體具有高感染效率、高滴度、高表達(dá)、可感染分裂和不分裂的靶細(xì)胞等許多優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)重組腺病毒感染宿主細(xì)胞后,外源基因可持續(xù)表達(dá)2周以上,而不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中,保證宿主細(xì)胞相對(duì)安全。臍帶血作為來(lái)源豐富的造血干細(xì)胞,不易出現(xiàn)復(fù)制衰老和免疫衰老。甚至在人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human

3、leukocyteantigen,HLA)不匹配時(shí),臍帶血移植也較少出現(xiàn)慢性或急性移植物抗宿主反應(yīng)。利用攜帶Livinα基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(recombinantadenovirus,rAd)感染臍帶血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)制成疫苗,使得DC長(zhǎng)程有效提呈腫瘤抗原成為可能。
　　[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
　　1.構(gòu)建攜帶人livinα基因的復(fù)制缺陷重組腺病毒(rAd-livinα);
　　2.

4、誘導(dǎo)培養(yǎng)健康人臍帶血來(lái)源的DC細(xì)胞;
　　3.rAd-livinα感染DC細(xì)胞制作成DC疫苗。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　1.使用穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-livinα和骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,同源重組產(chǎn)生攜帶livinα基因的復(fù)制缺陷腺病毒rAd-livinα。rAd-livinα擴(kuò)增純化后,對(duì)其鑒定并使用TCID50方法檢測(cè)滴度。
　　2.取健康胎兒臍帶血獲得單個(gè)核細(xì)胞,CD

5、34磁珠分選獲取前體DC。將細(xì)胞培養(yǎng)在含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,并添加GM-CSF、SCF以及IL-4誘導(dǎo)DC成熟。
　　3.第5天根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù),在MOI值200下加入rAd-livinα感染DC,第7天在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加TNF-α促進(jìn)DC細(xì)胞成熟。即得rAd-livinαDC疫苗。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　1.rAd-livinα經(jīng)PCR擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的片段,證明rAd-livinα構(gòu)建成功。病毒滴度為2

6、×109TCID50/毫升。
　　2.培養(yǎng)的成熟DC細(xì)胞呈現(xiàn)典型的顆粒增多,體積增大,突起變長(zhǎng)的不規(guī)則形態(tài)。成熟DC細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)增多。
　　3.rAd或rAd-livinα感染DC細(xì)胞后,細(xì)胞可呈現(xiàn)綠色熒光。rAd-livinαDC即為腫瘤疫苗。
　　[結(jié)論]
　　通過(guò)同源重組產(chǎn)生攜帶livinα基因的復(fù)制缺陷腺病毒rAd-livinα。使用磁珠分選從嬰兒臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中獲取前體DC。在多種細(xì)胞因子作

7、用下成功誘導(dǎo)前體DC分化、成熟。rAd-livinα感染DC細(xì)胞后即獲得rAd-livinαDC腫瘤疫苗。做好了為下一步應(yīng)用研究的前期準(zhǔn)備。
　　第二部分:rAd-livinαDC疫苗對(duì)肺癌細(xì)胞系的殺傷效率及作用機(jī)制
　　[實(shí)驗(yàn)背景]
　　細(xì)胞免疫是機(jī)體殺傷腫瘤的最主要環(huán)節(jié),有理由認(rèn)為L(zhǎng)ivin蛋白可作為抗原通過(guò)APC的MHCⅠ和MHCⅡ類(lèi)分子提呈,從而活化特異性抗Livin的CD4+和CD8+T細(xì)胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)

8、通過(guò)構(gòu)建攜帶人livinα基因修飾的小鼠DC疫苗能誘導(dǎo)出抗腫瘤特異性CTL,并產(chǎn)生有明顯作用的抗小鼠Lewis肺癌的效應(yīng)。除了CTL外,在人的免疫系統(tǒng)中還存在一些非特異性的免疫細(xì)胞,如自然殺傷細(xì)胞(NKcells)、巨噬細(xì)胞等也能發(fā)揮抗瘤作用。因此本研究中,我們將對(duì)livinα基因修飾的臍帶血來(lái)源的DC疫苗激活臍帶血來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞(主要成分為CTL)對(duì)肺癌細(xì)胞系的殺傷效率進(jìn)行探討。除研究抗livin特異性T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用外,本實(shí)驗(yàn)

9、還觀察在DC疫苗發(fā)揮作用過(guò)程中淋巴細(xì)胞向各個(gè)亞群分化的情況,以及特異性抗livinT淋巴細(xì)胞數(shù)量變化,從而進(jìn)一深入探索rAd-αDC疫苗對(duì)肺癌細(xì)胞系的殺可能的傷作用機(jī)制。
　　[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
　　1.證實(shí)rAd-livinαDC疫苗表達(dá)livinα蛋白;
　　2.評(píng)估rAd-livinαDC疫苗激活的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)Livin相關(guān)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率,研究這種殺傷效率是否具有特異性;
　　3.研究rAd-livinαDC疫

10、苗對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群分化的影響,以及抗livin特異性T淋巴細(xì)胞的測(cè)定。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　1.Westernblot方法檢測(cè)A549、H460、HBE、rAd-cDC、rAd-livinαDC和單個(gè)核細(xì)胞Livin蛋白表達(dá);
　　2.以CFSE標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,與激活的效應(yīng)細(xì)胞按比例混合,相互作用后使用AnnexinⅤ/PI染料通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)靶細(xì)胞凋亡;
　　3.通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)四組T淋巴細(xì)胞亞群相應(yīng)

11、的特異性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet,GATA3,FOXP3和RORC從而檢測(cè)T細(xì)胞向Th1、Th2、Treg和Th17亞群,分化;流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)抗Livin特異性T細(xì)胞:Th1(CD4+IFN-γ+Tcell)、Tc1(CD8+IFN-γ+Tcell)、Th2(CD4+IL-4+Tcell)和Tc2(CD8+IL-4+Tcell)。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　1.livin蛋白表達(dá)于A549、H460腫瘤細(xì)胞系和rAd-livinα感

12、染后的DC細(xì)胞,不表達(dá)于HBE細(xì)胞系和臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
　　2.rAd感染DC細(xì)胞后,可促進(jìn)DC細(xì)胞成熟和分化,增強(qiáng)DC細(xì)胞功能。rAd感染的DC細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,rAd-livinα感染的DC細(xì)胞除誘導(dǎo)Th1細(xì)胞增多外,特異性Tc1淋巴細(xì)胞較對(duì)照組顯著增多。
　　3.rAd-hlivinαDC能增強(qiáng)腫瘤特異性CTL細(xì)胞毒作用,而較少出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)。
　　[結(jié)論]
　　利用攜帶livinα基因的