1、糖尿病已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，到目前為止，仍然沒(méi)有理想的治療方法。胰島細(xì)胞移植治療1型糖尿病和部分2型糖尿病的相關(guān)研究取得了很大進(jìn)展。但供體不足及免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重阻礙胰島細(xì)胞移植的推廣應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的胰島細(xì)胞。然而如何高效而定向的誘導(dǎo)分化仍然是一個(gè)

2、大的挑戰(zhàn)。胰島細(xì)胞分化的機(jī)制是由一系列胰腺發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控完成的。DNA甲基化水平參與組織特異性基因的調(diào)控，從而參與干細(xì)胞分化。本試驗(yàn)在優(yōu)化分離培養(yǎng)兔BMSCs方法的基礎(chǔ)上，研究甲基化抑制劑5-aza-dC對(duì)兔BMSCs向胰島細(xì)胞分化的作用和適宜濃度，探討DNA甲基化水平與胰島β細(xì)胞分化的關(guān)系，為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　1.本試驗(yàn)采用紅細(xì)胞裂解法分離兔BMSCs，利用全骨髓法的原理對(duì)BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)化傳

3、代條件和接種密度，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定BMSCs表面標(biāo)志，細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定第3代和第8代兔BMSCs生長(zhǎng)曲線并計(jì)算群體倍增時(shí)間，得出采用上述方法分離培養(yǎng)兔BMSCs，能夠得到細(xì)胞純度高，活力強(qiáng)的BMSCs。
　　2.本試驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)甲基化抑制劑5-aza-dC對(duì)兔BMSCs細(xì)胞活力的影響，篩選出作用兔BMSCs適宜的5-aza-dC濃度為0.2-1μmol/L。采用5-aza-dC(1μ mol/L，96h)對(duì)兔BMSCs進(jìn)行誘

4、導(dǎo)前期處理，與未添加5-aza-dC的誘導(dǎo)組進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比、雙硫腙染色鑒定胰島素分泌對(duì)比、免疫熒光鑒定PDX-1蛋白表達(dá)對(duì)比。結(jié)果表明應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC聯(lián)合DMSO、尼克酰胺、高糖誘導(dǎo)后的BMSCs具備分泌胰島素的能力、并表達(dá)胰島細(xì)胞的特異標(biāo)志，表明甲基化抑制劑5-aza-dC能夠促進(jìn)胰島細(xì)胞的分化和β細(xì)胞成熟。
　　3.本試驗(yàn)在試驗(yàn)二的基礎(chǔ)上對(duì)應(yīng)用甲基化抑制劑5-aza-dC處理的誘導(dǎo)后胰島細(xì)胞，通過(guò)提取RNA，然