1、中山大學碩士學位論文廣州管圓線蟲LDH基因的克隆、表達及免疫診斷價值初步研究姓名：程梅申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：詹希美20060501廣州管圓線蟲LDH基因的克隆，表達及免疫診斷價值初步研究中文摘要同工酶，是糖酵解途徑的末端酶，利用NADH為輔酶，催化丙酮酸和乳酸之間的氧化和還原反應。LDH的同工酶在組織分布，動力學特征，理化性質及免疫學特性等方面均有很大不同。在人體，LDH已成為一種常用的臨床醫(yī)用診斷用酶。已知絕大多

2、數(shù)體內寄生蟲能量代謝的主要途徑是無氧糖酵解，因此研究寄生蟲LDH與宿主LDH在分子結構及功能上的差異對于寄生蟲的能量代謝、寄生蟲病的免疫診斷、疫苗研究和新抗蟲藥物的研發(fā)都有著重要的意義。研究目的：解析廣州管圓線蟲LDH基因的結構及其特點，構建LDH基因的原核表達系統(tǒng)，優(yōu)化表達條件，鑒定重組LDH基因的免疫反應性，以期獲得能用于廣州管圓線蟲病診斷的基因工程重組抗原。研究方法：從廣州管圓線蟲幼蟲eDNA文庫隨機測序得到的全長Unigene中

3、識別出編碼LDH的基因，用生物信息學方法對其進行結構預測及同源性比較，用PCR方法從幼蟲eDNA文庫中擴增出該基因，測序，定向克隆到原核表達載體pET30a()，在大腸桿菌BL21中表達，優(yōu)化表達條件，得到高效表達的工程菌pET30a()LDH，按照Ni—IDAHisBindPurificationKit說明書純化重組蛋白，用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析。用廣州管圓線蟲病人血清及廣州管圓線蟲感染的不同時期小鼠

4、血清進行免疫印跡鑒定純化蛋白的免疫反應性，并進行ELISA分析。研究結果：1廣州管圓線蟲LDH基因全長1008bp，編碼335個氨基酸，氨基酸序列的理論分子量(Mw)為3666kDa，等電點(pI)為838。氨基酸序列與秀麗隱桿線蟲LDH的同源性最高，達72％(237／328)，與果蠅LDH的同源性為62％，與華支睪吸蟲LDH、日本血吸蟲LDH的同源性分別為52％和55％，與剛地弓形蟲LDH及惡性瘧原蟲LDH的同源性分別為25％和24％