1、弓形蟲主要表面抗原1(SAG1)是目前國內(nèi)外研究較多的具有強免疫原性的優(yōu)勢診斷分子，該研究前期工作已實現(xiàn)了SAG1在大腸桿菌的可溶性表達，且證實其具有良好的免疫反應性。該文在此基礎之上，進行了以下研究： 1.標準血清的鑒定標準血清的確定是評判試劑盒質(zhì)量的前提，該研究采用免疫電鏡技術確定免疫兔血清、SAG1單克隆抗體和正常兔血清中針對膜抗原的抗體的有無，并以此作為標準參考血清，建立玻片蟲體酶聯(lián)染色試驗(TSHE)和免疫印跡試驗(I

2、B)方法；用TSHE和IB確定了一批弓形蟲IgG和IgM抗體陽性和陰性血清，為評價基于重組抗原的弓形蟲檢測試劑盒提供了可靠的標準血清。 2.弓形蟲rSAG1蛋白的表達、純化及鑒定標準化試劑盒的構建需要規(guī)模化生產(chǎn)抗原，以搖菌方式獲得目標蛋白因較難避免抗原的批間差異而滿足不了需要。該研究比較了搖菌、普通發(fā)酵和高密度發(fā)酵3種工藝生產(chǎn)重組弓形蟲主要表面抗原1(rSAG1)的表達量和產(chǎn)量。結果3種所獲目標蛋白的表達量均占菌體蛋白30％左右

3、。搖菌、普通發(fā)酵和高密度發(fā)酵所獲得目標蛋白產(chǎn)量分別為1.65g/L、1.82g/L和6.74g/L。高密度發(fā)酵比普通發(fā)酵的成本低，一罐11.5L的高密度發(fā)酵可獲目標蛋白77g，按常規(guī)包被量估算可以制備3千8百萬人份的檢測試劑盒，滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求。 為探索rSAG1純度對檢測效果的影響，該研究用Ni-NTA層析、Sephadex-G75層析和切膠純化等三種純化方案進行配伍和條件優(yōu)化，摸索rSAG1的最佳純化工藝。SDS-PAG

4、E和凝膠分析結果顯示：經(jīng)Ni-NTA一步純化，純度為72.36％；經(jīng)Ni-NTA和Sephadex-G75兩步純化，純度為98.54％：經(jīng)Ni-NTA和切膠兩步純化，純度為97.39％。 為鑒定這3種工藝純化的rSAG1在ELISA檢測中的效果，該研究分別用這3種工藝純化的抗原包被ELISA板，檢測標準血清，結果顯示：經(jīng)Ni-NTA一步純化的rSAG1與后2種工藝純化的抗原相比，敏感性無統(tǒng)計學差異，但特異性顯著低于后2種。Ni-

5、NTA和Sephadex-G75柱層析兩步純化工藝與Ni-NTA和切膠法兩步純化工藝相比，不僅操作簡便、成本較低，而且可實現(xiàn)規(guī)?；?。該文采用此方法批量純化了rSAG1，實現(xiàn)了rSAG1蛋白的中試生產(chǎn)與純化。 3.該研究用弓形蟲速殖子可溶性抗原、不同純度的融合型rSAG1和經(jīng)腸激酶切割后的非融合型rSAG1蛋白以及經(jīng)菌體蛋白或硫氧還蛋白吸收過的血清組合成6組ELISA檢測方案。結果表明：①低純度的融合型rSAG1-ELISA檢測方

6、案的特異性較高純度的融合型rSAG1-ELISA低，并且通過大腸桿菌預吸收血清處理難以達到理想的水平；②高純度的融合型rSAG1-ELISA檢測方案的特異性較非融合型rSAG1-ELISA檢測方案低，Westernblot結果表明這是由硫氧還蛋白引起的；③高純度的融合型rSAG1-ELISA檢測方案可以通過硫氧還蛋白預吸收血清處理而達到與非融合型rSAG1-ELISA相同、且較天然蟲體抗原好的理想效果，且成本較低。結論：高純度的融合型r

7、SAG1可以達到弓形蟲特異性IgG抗體檢測試劑盒標準化生產(chǎn)的要求。 4.rSAG1特異性IgM抗體檢測體系的建立弓形蟲IgM抗體陽性提示近期感染，但用速殖子抗原建立的IgM檢測方法易受類風濕因子等因素干擾而出現(xiàn)非特異性反應。該文分別用rSAG1和弓形蟲速殖子可溶性抗原建立rSAG1-ELISA和TOXO-ELISA，檢測弓形蟲IgM抗體陽性和陰性血清，結果顯示：rSAG1-ELISA與TOXO-ELISA的敏感性相同，而rSAG

8、1-ELISA較TOXO-ELISA的特異性高。提示：rSAG1用于弓形蟲IgM抗體的檢測優(yōu)于天然的蟲體抗原，這為用rSAG1構建弓形蟲IgM抗體標準化檢測試劑盒提供了依據(jù)。 該文用最佳包被濃度的羊抗人IgM包被ELISA板，并分別以rSAG1和速殖子可溶性抗原作結合抗原，分別以HRP標記的兔抗弓形蟲IgG和SAG1單克隆抗體(Y3A8和K7H3)作為結合抗體，配伍成8組C-ELISA方案，檢測弓形蟲IgM抗體。結果顯示：兔抗弓

9、形蟲IgG與rSAG1配伍較之與速殖子抗原配伍效果好；Y3A8無論是與rSAG1還是與弓形蟲速殖子抗原配伍，反應的OD值及P/N比值均較低；K7H3在與抗原的配伍中，OD值較Y3A8高；而Y3A8和K7H3聯(lián)合與rSAG1配伍時，OD值和P/N比值均為最高。進一步用Y3A8和K7H3聯(lián)合與rSAG1組成的C-ELISA血清樣本，結果顯示：C-ELISA的特異性與rSAG1-ELISA相同，但其敏感性較rSAG1-ELISA低。進一步提示

10、rSAG1在弓形蟲IgM抗體檢測中具有潛能。 5.弓形蟲標準化rSAG1-ELISA試劑盒的構建與應用在上述研究結果的基礎上，經(jīng)過了一系列制作工藝的優(yōu)化：①以最佳包被濃度包被ELISA板；②從4種不同配方的封閉液中挑選效果最佳者對抗原板進行封閉；③根據(jù)抗原板在不同條件下存放不同時間后的檢測效果，從3種不同配方的保護劑中挑選最佳者對抗原板進行保護處理；④從5種不同配方的血清稀釋液挑選P/N值最高且OD值大于0.5者作為試劑盒的血清

11、稀釋液；⑤采用棋盤法從3種不同配方的稀釋液與酶結合物的濃度選擇最佳者作為試劑盒的酶結合物；⑥用棋盤法確定試劑盒的血清和酶結合物的作用時間和洗滌條件；⑦檢測1170例普查血清，計算OD450平均值和SD，以平均值×2.1+2SD為判斷標準；并經(jīng)多次重復測定的變異系數(shù)制定試劑盒的臨界值參考血清；⑧配以陰陽性參考血清、穩(wěn)定的濃縮洗滌液、底物液、顯色液和外包裝盒；構建rSAG1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA檢測試劑盒。

12、 試劑盒的性能： 1)隨機抽取10份血清在保質(zhì)期內(nèi)的不同時間進行10次測試，測試結果10份標本的變異系數(shù)都在5％以下，表明試劑盒的重復性好。 2)根據(jù)中國藥品監(jiān)督管理局的檢定要求，將構建的試劑盒于4℃保存、37℃放置1d、2d、3d后檢測10例陽性血清樣本。結果10例樣本的OD值均在臨界值之上，表明試劑盒的保質(zhì)期至少為半年。試劑盒的單項穩(wěn)定性試驗結果表明：抗原板室溫存放2年后，血清稀釋液、底物液和顯色液4℃存放1年以

13、后，檢測結果都在可靠范圍內(nèi)。表明試劑盒的穩(wěn)定性好。 3)經(jīng)標準血清的鑒定，rSAG1-IgG-ELISA試劑盒的敏感性、特異性、陽性預示值、陰性預示值和符合率均在97％以上，約登指數(shù)為0.95。rSAG1-IgM-ELISA試劑盒的敏感性為92.8％，特異性為100％，約登指數(shù)為0.93，與TSHE和IB的符合率為98.4％。 4)與國內(nèi)外同類產(chǎn)品比較結果顯示：rSAG1-IgG-ELISA試劑盒與意大利DIESSE弓形

14、蟲檢測試劑盒和某國產(chǎn)試劑盒相比，敏感性和特異性不具統(tǒng)計學差異，但約登指數(shù)(0.95)較DIESSE(0.93)和國內(nèi)(0.74)產(chǎn)品高。rSAG1-IgM-ELISA檢測試劑盒的敏感性顯著高于國產(chǎn)試劑盒，而且約登指數(shù)(0.93)高于DIESSE(0.86)和國內(nèi)(0.27)產(chǎn)品。從整體性能來看，rSAG1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA檢測試劑盒優(yōu)于所檢測的國內(nèi)外同類產(chǎn)品。 試劑盒的應用： 用rSAG

15、1-IgG-ELISA和rSAG1-IgM-ELISA試劑盒檢測1714例血清，結果顯示：IgG總陽性率為8.27％，IgM總陽性率為0.88％，IgG和IgM同時陽性為0.18％。省CDC等十多家單位應用后，對此試劑盒的性能和診斷效果均給予了較高的評價。 該研究對不同發(fā)育階段的廣州管圓線蟲抗原成分及其免疫反應性進行分析，結果顯示：不同階段的蟲體蛋白譜大致相同；各階段蟲體及雌、雄蟲存在的差異性蛋白條帶中，除雌蟲Mr33000與感

16、染早期大鼠血清出現(xiàn)免疫反應外，其他條帶在Westernblot中均未出現(xiàn)反應。各個發(fā)育階段蟲體的Mr40000、50000、66000和80000能被感染大鼠血清識別，但與感染后1周大鼠和健康大鼠血清也出現(xiàn)反應，提示這些分子可能在用蟲體粗抗原作靶抗原的免疫診斷中引起非特異性反應。2～3周幼蟲的Mr104000抗原與感染后2周的大鼠血清出現(xiàn)強烈的反應帶，而隨著蟲齡的增長，該區(qū)帶的反應變?nèi)?，推測該抗原為廣州管圓線蟲的期特異性抗原，具有潛在的

17、早期診斷價值。雌蟲的Mr33000及所有蟲體的Mr32000抗原與2周感染血清出現(xiàn)反應，與感染3周后大鼠血清均出現(xiàn)強反應，與正常大鼠血清均未見明顯的反應，說明Mr32000和33000抗原在廣州管圓線蟲病的早期診斷和流行病學調(diào)查具有潛在的應用價值。 利用切膠法從廣州管圓線蟲粗抗原中純化出Mr32000(AC32)，并構建了AC32-ELISA和免疫膠體金滲濾(DIGFA)檢測體系。兩個體系檢測40份感染3w的大鼠血清和21份感染

18、4-6w大鼠血清全部為陽性，1例臨床確診的廣州管圓線蟲病人血清呈強陽性反應；5例正常大鼠血清和50例獻血員血清未出現(xiàn)假陰性反應，與20例急性血吸蟲病人血清、45例華支睪吸蟲病人血清等其它寄生蟲感染人血清均未出現(xiàn)交叉陽性反應。表明AC32-ELISA和AC32-DIGFA試劑盒具有較高的敏感性和特異性，而且可以用于廣州管圓線蟲病的早期診斷。試用單位也對AC32-ELISA試劑盒作出了較好的評價。這為該試劑盒的進一步研發(fā)打下了基礎。DIGF